革兰氏染色法的原理及其练习

摘要：革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，所以学习微生物学，进行革兰氏染色实验是很重要的。为保证染色结果的正确性，采用规范的的染色操作方法是十分必要。本实验主要对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、枯草杆菌 （Bacillus subtilis）进行革兰氏染色，观察它们的染色特征，辨别是革兰氏阴性还是阳性，从而掌握其染色方法。染色方法与过程很清晰，但实验结果中金黄色葡萄球菌(S.aureus Rosenbach）多组呈现假阴性。本实验的主要目的是熟悉并掌握革兰氏染色方法及原理，但要想做出很好的染色得多加练习。本实验还可以锻炼显微镜操作技术和无菌操作技术。 关键词：革兰氏染色 大肠杆菌(E.coli) 金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach) 枯草杆菌(B.subtilis)

引言

革兰氏染色是微生物学中最重要的鉴别染色方法，它可以直接将细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构组成与结构的差异所决定的。经过一定的染色过程后，革兰氏阳性的细菌会因为细胞壁肽聚糖的含量高，脂质含量低而保持第一次染色的蓝紫色。革兰氏阴性细菌细胞壁的脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，蓝色被洗脱，复染后变为红色。革兰氏染色原理很简单，染色时需注意要注意使用处在活跃生长期的细菌，涂片不宜过厚，严格控制脱色时间。

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实验原理：

1）G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。G-菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，导致细胞壁通透性增加，胞内结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色。

2）G+菌等电点（PI2~3）比G-菌（PI4~5）低，在相同PH条件下，G+菌所带负电荷比G-菌多，故与带电的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。

实验步骤：

一、标本的制备：

1、涂片：

　　取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握菌种管，有搜持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取斜面培养的葡萄球菌或大肠杆菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。

2、干燥：

     目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。

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华中科技大学微生物学实验报告

班    级：    生物制药1101班        日    期： 20## 年 3 月  16  日

指导教师：   邬建国                 实验组别：  启明七组                  

姓    名：    何明                  组员姓名：  张玉涛、王远馨                   

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革兰氏染色法

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家 Christain Gram创立。

细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。 另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。

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一、实验题目：微生物的革兰氏染色

二、实验目的：

1、学习并初步掌握革兰氏染色法；

2、了解革兰氏染色的原理；

3、巩固显微镜的使用。

三、实验原理：

革兰氏染色是1884年丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分：

1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片；

2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物；

3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色；

4、复染：复红配成碳酸复红作为复染剂。

G-和G+细胞壁的比较：

1、阳性（G+）菌细胞壁特点：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖构成，肽聚糖含量高，结构紧密，脂类含量低。当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。

2、阴性（G-）菌细胞壁特点：细胞壁薄，由两层构成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状结构交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性增强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，因此，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（例如大肠杆菌）。

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实验一：细菌、放线菌的形态

      观察与革兰氏染色

姓名:陈虹邑

学号：200911233012

系别：生物科学与生物技术

班级：周二第一组

试验日期：20##年9月13日

同组成员：邢悦婷  呼波

一、     实验目的及意义

1、巩固油镜的使用;

2、掌握细菌形态观察的基本方法；

3、了解细菌的基本形态和结构。

4、了解革兰氏染色的原理；

5、初步掌握细菌涂片的方法；

6、掌握革兰氏染色的方法；

7、掌握放线菌的涂片方法；

8、观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。

二、     实验材料与方法

【实验材料】

菌种：溶血链球菌(Strptococcus haemolyticus),螺菌(Spirillum sp.) ,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium), 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis), 普通变形菌(Proteus vulgaris), 丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetotylicum), 褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)等细菌永久装片，放线菌5406，金黄色葡萄球菌（staphulococcus aureus），大肠杆菌（E. coli）

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实验一 革兰染色法、细菌的特殊染色法

实验目的：掌握细菌革兰染色的原理与方法；

掌握细菌芽孢染色的基本原理与方法；

熟悉普通光学显微镜的油镜使用与保养方法。

实验材料：菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

试剂：结晶紫、碘液、95%乙醇、番红花红、孔雀绿

实验内容：

1.革兰染色

染色方法：革兰染色法是细菌学中最广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染剂（增加染料和细胞的亲和力）后，用脱色剂（酒精或丙酮）脱色，再用复染剂染色。如果细菌不被脱色而保存原染液颜色者为革兰阳性菌(G＋)；如被脱色，而染上复染液的颜色者为革兰阴性菌(G-)。此染色法可将所有具有细胞壁的细菌分为两大类：革兰阳性菌和革兰阴性菌。

染色原理：现在认为细菌对革兰染色的不同反应主要是革兰阳性菌和阴性菌的细胞壁结构与化学组成不同。革兰阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量多，且交联度大，脂类含量少，经95％乙醇脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，与细胞结合的结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细胞仍保留初染时的颜色。而革兰阴性菌的细胞壁较薄，含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少，乙醇脱色时溶解外层类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染的颜色。

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实验二细菌的普通染色和革兰氏染色

一、             实验目的

1．  掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；

2．  掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；

3．  识别细菌的革兰氏染色结果；

4．  学习无菌操作技术 。

二、             实验原理

    一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。

    虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

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