酶联免疫吸附实验

免疫酶技术是本世纪60年代末期发展起来的一种免疫检测方法，是目前最广泛应用的标记免疫技术。1966年Nakene和Pierce共同发表了《酶标抗体：制备和抗原定位中的应用》，首先提出了免疫酶技术的基本原理。1971年Engvall和Perlmann发表《酶联免疫吸附试验测定IgG含量》一文，使免疫酶技术成为一种实用的检测液体标本中微量物质的方法。目前免疫酶技术已广泛用于免疫学、微生物学、寄生虫学等。由于其具有灵敏度高、试剂稳定、设备简单、操作安全等优点，近几年也将其应用到食品领域中来检测某些食品中的生理活性物质。

一、基本概念

1、免疫：笼统地概括起来，免疫就是人和动物机体防御、排除外来物质(异物)进人体内，同时识别和清除体内死亡、变性物质和平定体内叛乱分子突变细胞，以保护和稳定自身的防护机制。

2、抗原：抗原是指那些能够诱导机体的免疫系统发生免疫应答，产生抗体和致敏效应淋巴细胞，并在体内外与之特异性结合，发生免疫反应的物质。

3、抗体：是能与相应的抗原专一性结合的蛋白质分子，和机体其他生物大分子一样是细胞的产物，分泌到体液中或表现在细胞表面上。

4、抗原、抗体反应：抗原和抗体在体外的反应亦称血清学反应。这类反应可借助免疫学方法进行检测。

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基本原理

19xx年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得19xx年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 方法类型和操作步骤

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

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实验二 酶联免疫吸附实验（ELISA）

一、实验目的

熟练掌握ELISA 技术

二、实验原理

酶联免疫吸附实验（ELISA）是目前应用最多的免疫酶技术，它是使抗原或抗体吸附于固相载体，使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行，从而简化了分离步骤，提高了灵敏度，即可检测抗原，也可检测抗体。实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。

为了检测抗原可用夹心法。将特异性抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔）上，然后加被测溶液，倘样品中有相应抗原，则与抗体在载体表面形成复合物。洗涤后加入酶标记的特异性抗体，后者通过抗原也结合到载体的表面。洗去过剩的标记抗体，加入酶的底物，在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比，可用肉眼观察或分光光度计测定。

为了检测抗体可用间接法。使抗原吸附于载体上，然后加入被测血清，如有抗体，则与抗原在载体上形成复合物。洗涤后加酶标记的抗球蛋白（抗抗体）与之反应。洗涤后加底物显色，有色产物的量与抗体的量成正比。

本实验使用的乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒是采用双抗原夹心法检测抗-HBs，即采用纯化HBsAg 包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP，当标本中存在抗-HBs 时，该抗-HBs 与包被HBsAg 结合并与酶结合物形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP 复合物，加入TMB 底物产生显色反应，反之则无显色反应。

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实验二酶联免疫吸附试验

1.实验目的

①了解ELISA反应原理、类型及特点

②掌握直接ELISA操作步骤

③通过实验认识抗体的双重性

2.实验原理

① 抗原或抗体能物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附后的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。

②酶可与抗体通过共价键连接而形成酶标记抗体，这种结合作用并不影响抗体的免疫学活性和酶的催化活性。

③酶标抗体中的酶可催化无色底物形成有色产物，酶标抗体与相应抗原或抗体结合后，可根据有无颜色反应来判定是否有免疫反应发生，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比，因此，可以按底物显色的程度来显示试验结果。

3.实验器材及试剂

3.1器材

微量移液器，酶标仪、洗板机、96孔酶标板、PHSJ-4A型pH计等

3.2试剂

显色剂（TMB）、兔抗鸡IgG-HRP、牛血清白蛋白（BSA）、

Tween-20、标准品鸡IgG

3.3 各种缓冲液

（1）包被液（0.05 M碳酸盐缓冲液， pH 9.6）

  0.lM Na2C03  1.59 g, 0.1M NaHCO3  2.93 g, 加DDH20（DDW） 至1 L，用精密pH计调整pH值到9．6；

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酶联免疫吸附实验 ELISA

一．实验目的

酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。

二．实验原理

用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

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酶联免疫吸附试验与胶体金免疫层析试验在乙型肝炎表面抗原检测中的应用比较

作者：叶永志

来源：《维吾尔医药》20xx年第06期

摘要：目的：探讨酶联免疫吸附试验与胶体金免疫层析试验在乙型肝炎表面抗原检测中的应用。方法：将我中心门诊体检及检测HBsAg患者300例，分别采用ELISA法及胶体金免疫层析试验检测HBsAg，比较两种检测方法的灵敏度、特异性。结果：ELISA与胶体金免疫层析法检测结果差异无统计学意义（P>0.05）。ELISA法检测灵敏度显著高于胶体金免疫层析试验，差异有统计学意义（P

关键词：酶联免疫吸附试验；胶体金免疫层析试验；乙型肝炎；表面抗原

我国乙型肝炎发病率高，为严重危害人民身体健康的传染病之一。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）为乙肝病毒感染的诊断标志物之一，HBsAg对于乙肝的预防及治疗意义重大[1]。目前常用的实验室检测方法为ELISA及胶体金免疫层析试验。ELISA法操作复杂，对相应仪器，检测时间等条件要求较高。胶体金免疫层析操作方便，快速，结果易于观察[2]。本研究对我中心20xx年12月～20xx年12月门诊体检及检测HBsAg患者300例，分别采用ELISA法及胶体金免疫层析试验检测，报道如下：

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影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施

酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。

1 实验室操作人员的基本素质因素

实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。 2 标本处理因素

实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。 3 操作过程的影响因素

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酶联免疫吸附试验（ELISA）——直接法

一、 原理

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。在本实验中，以辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体，与相应抗原IgG结合，标记的酶可催化底物（邻苯二胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。

二、材料：

1. 人IgG包被的微量酶标反应板（1：1万，1：10万，1：40万，1：80万，1：100万），

2. 酶标抗人IgG抗体稀释液、 洗涤液（PH7.4，0.01M PBS-Tween20）、底物溶液，

3. 微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、37℃恒温箱等。

三、方法：

1. 人IgG包被微量酶标反应板：取人IgG各100ul，分别加入第1至5孔，设第6孔为对照。置37℃恒温箱2小时，取出，移入4℃冰箱过夜。取出，用洗涤液洗3次，3分钟/次（略）。

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