实验四植物基因组DNA的提取

实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。

实验原理 利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 实验材料: 新鲜植物叶片

【仪器、材料与试剂】

（－）仪器

1．低温离心机

2．恒温水浴器

3．台式离心机

4．紫外分光光度计

5.液氮灌

（二）材料

l。三羟甲基氨基甲烷（Tris）

2．乙二胺四乙酸（EDTA）

3．氯化钠（NaCl）

4．β-巯基乙醇

5．氯化钾（KCI）

6．异丙醇

7．乙醇

8.．陶瓷研钵

9．吸头、小指管（三）试剂

（三）试剂

1．细胞提取液

100 mmol／L Tris.HCl (pH 8.0)

5 mmol／L EDTA (pH 8.0)

500 mmol／L NaCl

1.25％ SDS

1 mol／L β巯基乙醇

2．5 mol／L KCI

3，TE（见实验二质粒DNA的提取及酶切）

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实验二 植物基因组DNA的提取

Tris 读音 “吹斯”

脱氧核糖核酸酶DNase

是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。

苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂， 造成DNA降解。苯酚使蛋白变性，离心时沉淀下来，而DNA溶解在溶液中。

    在提取DNA时用的原料成分的关系,很多植物源提取材料里面含有酚类物质,酚类物质是芳族环上的氢原子被羟基或功能衍生物取代后生成的化合物.酚类物质如果经氧化后就会很容易于DNA共价结合引起褐变.这就是褐变现象,为有效除去酚类物质，需要在研磨时加入抗氧化的PVP，用PVP是利用它的“CO-N=”基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强，结合成复合物后,通过离心除去。另外，在加入提取液时，加入B-巯基乙醇可使多酚氧化酶失活，防止酚类物质被氧化，主要是“-SH基”可以打断多酚氧化物酶的二硫键而使之失活，防止酚类化合物被氧化。

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实验1 转基因植物PCR检测

一、植物DNA的提取技术(CTAB法)

一、实验目的

1.掌握用CTAB法提取植物总DNA的方法和基本原理。

2.学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、原理

CTAB法[十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)]是一种快速简便的提取植物总DNA的方法。通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，然后加入CTAB，CTAB是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使核酸(DNA、RNA)得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

大豆幼苗[材料的采集与保存对提取DNA的产量和质量有很大影响。通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料，采集过程中应尽可能保持组织材料所含的水分。通常的做法是取样时立即用浸湿的纱布包裹采集到的组织材料，放置在带有冷藏功能的采集箱中，这样通常使组织材料在3-5d内仍然保持新鲜。野外远距离采集样本时，在可能的条件下应冷冻保存（如放置于液氮中）；当不具备冷冻条件时，最好用盛有无水CaSO4的瓶子分别保存，使其迅速干燥，这种方法可将材料保存数月，返回后应尽快进行DNA的提取工作。那些具有大量次生代谢产物（如单宁、酚类、醌类等）的植物材料，应尽可能采集幼嫩组织。]

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实训一 植物组织中DNA的提取测定

（CTAB法提取植物基因组DNA）

【实验背景】

高等动物，高等植物的基因组相当宠大，某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而提取要求是获得纯度高和收得率高。

真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞；然后去除蛋白质，糖类；最后纯化出ＤＮＡ，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的ＤＮＡ。

【实验目的】

掌握植物材料基因组DNA的CTAB法提取分离基本原理和方法，掌握微量移液枪、液氮研磨、微型试管、高速离心机等使用操作技术。

【实验原理】

植物组织采用液氮研磨达到细胞破碎，细胞内容物采用SDS 或CTAB分离蛋白质、多糖，再由苯酚、氯仿、异戊醇混合液萃取纯化，RNA由RNA酶消化，分离出的DNA由无水乙醇沉淀分离。

【材料仪器】

材料：幼嫩的植物材料1.0ｇ左右。

仪器：移液器、电子天平、恒温水浴箱、离心机、EP管、液氮、研体等。

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1.选题依据

1.1 论文题目及研究领域

1.1.1 论文题目: 木本植物基因组ＤＮＡ提取方法的对比研究

1.1.2 研究领域: 木本植物DNA的提取研究

1.2 论文研究的理论意义和应用价值

DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。植物DNA的提取和纯化是植物基因工程研究的基础操作，实施分子标记，基因文库的构建，基因分离及遗传转化和鉴定等都是以提取DNA为前提。如何简捷高效地提取到纯净、合格的DNA分子，一直是植物生物学者关注的问题。

随着DNA分子标记技术和重组DNA技术的发展，制备完整、纯度较高的基因组DNA日益显得重要。我们在进行木本植物DNA水平遗传多样性研究时，首先遇到的问题是如何快速获得较完整、纯度较高的基因组DNA。由于植物细胞与动物细胞不同，具有一层坚硬的细胞壁，且含有较多的多糖、色素、脂质和多酚等物质，给植物DNA提取带来很多困难，特别是多糖和多酚类物质不易与DNA分开。相对于草本植物，多年生木本植物的次生代谢类物质含量更高，高质量的DNA提取难度更大[1]。

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实验七 植物基因组 DNA 的快速提取

一、实验目的

1、学会并掌握微量移液器的使用。

2、熟练操作2×CTAB法提取植物基因组DNA。

二、 实验原理

采用机械研磨的方法在液氮中破碎植物组织和细胞，，由于植物细胞菌含有多种酶（尤其是氧化酶）对DNA的抽提产生不利影响，因此在CTAB中加入抗氧化剂（如β-巯基乙醇），降低这些酶的活性。CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂24:1（氯仿：异戊醇）抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

三、实验仪器及药品耗材

1、主要仪器：冷冻离心机、冰箱、移液器、水浴锅、摇床、研钵、剪刀和离心机等。

2、主要药品及耗材：一次性手套、5 ml 离心管、5 ml 离心管、移液器吸头、无菌水、CTAB、氯仿、异丙醇、异戊醇、无水乙醇、TE缓冲液、a-巯基乙醇、Tris-Hcl、EDTA、NaCL和液氮等。

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二．实验报告

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大肠杆菌和植物基因组DNA提取

生科基 彭健鹏 2012141242048

1.大肠杆菌DNA提取方案设计

实验目的

学习并掌握细菌基因组的提取方法

提取大肠杆菌DH5α中的DNA并进行质量检测

实验概述

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

试验准备

实验材料：大肠杆菌DH5α菌液

实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇

实验仪器与用具：微量移液器，低温离心机，水浴锅，eppendorf管，恒温摇床

实验步骤

（1）将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌液5000rpm冷冻离心10分钟弃上清；

目的：分离大肠杆菌与其培养液。

（2）加190μL TE悬浮沉淀，并加10μL 10%SDS，1μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；

目的：裂解大肠杆菌。

（3）加30μL 5mol/L NaCl，混匀；

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