实验四 凝胶过滤法分离蛋白质
课程名称：生物化学与分子生物学实验课 年级：2005
专业、层次：临床医学本科 授课教师：符伟玉
职称：讲师 学时：4学时
基本教材：自编《生物化学与分子生物学实验指导》
教学目的与要求：
1、熟悉凝胶过滤法分离蛋白质的基本原理。
2、掌握凝胶过滤法分离蛋白质的实验操作。
3、掌握凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别。
大体内容与时间安排：
1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理 10min
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实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质
一、实验目的
1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能
二、实验原理
凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
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实验报告
课程名称：生化实验B 实验日期：
班级： 姓名学号：
血红蛋白凝胶过滤
一、 背景及目的
血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。
凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。 凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。
影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度
2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH
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实验三 Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶
一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐
（一）目的和要求
掌握凝胶层析法的原理及操作技术。
（二）原理
凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
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生物化学实验预习报告
实验六 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
一、研究背景
电泳技术的发明是人们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上一次伟大的飞跃，在实际应用的过程中，人们发现了它在大量样品纯化上的劣势以及分析上的突出优点，进行“扬长避短”，最终将其作为生物大分子分离鉴定的常用技术而被保留与发展下来。自电泳技术发明以来，生命科学领域迅猛发展，人们对生物大分子的研究不能仅仅停留在分离、纯化、鉴定这些宏观操作上，需要确定它们的分子量进行更加深入的研究，所以迫切需要一种新技术能够测定像蛋白质这样的生物大分子的相对分子质量。人们又把目光转移到迅猛发展的电泳技术上来，试着去寻找突破口。在之前的非变性电泳技术中，生物大分子得以分离的基础是基于三方面的差异，即分子质量、分子大小与形状、电荷性质。如果要测定种生物大分子的分子质量，直接测定难度很大，这就需要首先找到一个参照标准（标准蛋白），在待测蛋白与标准蛋白之间进行“差异缩小”，将他们在电场中泳动速度的大小仅仅体现为分子量上的差异，再通过寻求某种线性关系就能得到蛋白质样品的分子质量。此外，人为地借助其他物质处理来缩小这些差异也就意味着破坏蛋白质的原有结构，变性电泳便成了必然。这一步是整个技术的核心，也是最难的突破的。1967年，Shapiro年首次报告了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，根据他对11种蛋白质电泳获得的结果，发现蛋白质（或亚基）分子量的对数与蛋白质分子的迁移率之间有直线关系。随后，Weber等人进行深入研究，肯定了Shapiro的发现，确立了以连续的磷酸盐系统作为电极缓冲系统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的新方法。后来，Laemmli将SDS电泳和Davis的不连续盘状电泳结合起来，设计出了不连续的SDS-Tris-甘氨酸系统。[1]由于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好、微量、设备简单、价廉和操作容易、迅速等优点，因而得到了迅速的发展和广泛的应用，目前已成为蛋白质研究的有力工具，广泛地应用于分子生物学、生物化学、遗传学、病理学、微生物学和植物生理学等学科的研究中。
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蛋白质生化实验报告
生殖免疫研究所
薛樱子
学号：1133111003
实验一 溶液中蛋白质浓度的测定
一 光吸收法（测量范围：0.1—2mg）
1实验原理：由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。
纯蛋白的A280/A260为1.8，纯核酸的A280/A260为
2步骤：
2.1）打开仪器的电源开关（接220V交流电），打开比色槽暗箱盖，选择光源，选档，选波长，用调零旋钮调暗电流至0 。
2.2）将空白对照样品和待测溶液装入石英比色杯
2.3）将仪器的比色槽暗箱合上，比色槽处于蒸馏水（或校正缓冲液）校正位置，旋转光量调节器使电表指针正确处于0 。
2.4）拉出比色槽手柄拉杆使比色槽处于样品位置读数。
2. 5）在260nm和280nm分别读数（分别用缓冲液调0），根据上表查处相应蛋白浓度，根据喜事倍数计算原溶液蛋白浓度，根据体积计算总蛋白量。
3结果与分析：
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实验一 蛋白质分子的测定─凝胶层析法
一、 实验原理
凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，小分子可以进入凝胶内部，流苏缓慢，一直最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得以分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，其内部都具有很微细的多空网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）和葡聚糖凝胶（Sephadex G）。其中葡聚糖凝胶是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。Vt由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo为“孔隙体积”、“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积；Vg为凝胶本身体积；Ve为洗脱体积，即自加入样品时算起到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积，Ve与Vo及Vi之间的关系为：Ve=Vo+KdVi，；Kd为样品组分在二相间的分配系数，Kd=(Ve-Vo)/Vi，有效分配系数为Kav，Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)。
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实验六 SDS-PAGE测定蛋白质分子量
生物111 杨明轩 1102040128
一、研究背景及目的
对于那些生物体内含量高、易于分离结晶获得纯品的蛋白，可以通过测定氨基酸序列，借助各种氨基酸的分子量求出蛋白的分子量，并与质谱等手段相互结合，得到精确可信的分子量。但对于那些含量少，不易分离的蛋白，无法实现结晶，就必须借助其他手段测定其分子量。
要找到能够测定分子量的实验手段，首先要考虑那些能够将不同分子按照其各自的分子量分离的技术。在众多的技术当中，密度梯度离心、层析、电泳都与物质的分子量有关。其中，超速离心机造价高，使用过滤层析色谱测分子量要做标准曲线，柱长要求高，且这些方法不够准确。因此，电泳技术成为了实现分子量测定这一目的的最佳选择。
但是，在活性电泳中，影响蛋白前迁移率的因素有蛋白质的电荷性质、分子大小和形状。要测定分子量，就要消除电荷、分子形状对蛋白迁移率的影响，即使得各种蛋白的电荷、形状不存在显著差异。对于电荷，使各分子不带电违背电泳的基本原理，而使各分子带点完全相同是无法实现的，因此考虑使其带上大量电荷，从而让分子之间的电荷差异可以忽略。在活性电泳中，改变样品的带电情况依靠的是缓冲液pH的变化，显然不能够使分子大量带电，这就表明必须向电泳体系中引入其他物质，与蛋白分子定量等量结合，且不改变分子量差异造成泳动差异。对于分子形状，考虑到功能性蛋白大多是球形粒子，要保持形状不变，就要实现对蛋白的包裹性结合。而蛋白表面的电荷分布情况千差万别，依靠电荷性质无法结合形成稳定的复合物。考虑到蛋白质中含有大量的疏水氨基酸，可以通过疏水作用结合，这就要造成蛋白变性，是疏水基团充分暴露出来，分子不能在维持球型而变成棒状，因此，所选择的物质还需要能够维持复合物形状的统一。基于以上考虑，科学家选择了双亲性物质，既能通过疏水作用与蛋白定量结合成牢固的复合物，又能借助亲水性在溶液中良好分散。
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