实验二

一  巨噬细胞吞噬功能实验

【原理】巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞，局域活跃的吞噬功能。吞噬细胞受抗原刺激后活化，可使吞噬功能明显增强。

在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡血红细胞，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷亚甲蓝染色，显微镜下计数吞噬红细胞的百分数，及观察吞噬细胞内鸡红细胞的数目，以判断吞噬细胞的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异性免疫水平。

【方法】体内法：

（1）实验前3小时，小鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。

（2）实验时，每只小鼠注射鸡红细胞1ml，轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀，利于吞噬。

（3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用载玻片轻擦腹腔，使腹腔液均匀涂于载玻片过，再滴一滴0.03%冷亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。

（4）高倍镜下进行观察，计数。

【结果】

【分析】

在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。

二  沉淀反应  双向琼脂扩散实验

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中性粒细胞吞噬细菌过程

1）识别和粘着：在血清调理素作用下，吞噬细胞借其表面的Fc和C3b受体，能识别被抗体和补体包被的细菌，后者经抗体或补体与吞噬细胞相应受体相结合，细菌就粘着在吞噬细胞表面。 2）吞入：细菌被粘着之后，吞噬细胞形成伪足将其包围，随着伪足的延伸并相互吻合，形成由吞噬细胞膜包围吞噬物的泡状小体－吞噬体（phagosome）。吞噬体逐渐脱离细胞膜进入细胞内部，与溶酶体融合，形成吞噬溶酶体（phagolysosome）。 3）杀伤和降解：吞噬溶酶体形成之后，吞噬细胞通过溶酶体酶（溶菌酶、杀菌素、酸性水解酶、乳铁蛋白等）可破坏细菌菌膜或菌体代谢噬细胞代谢产物如氧代谢活性产物和酸性代谢产物也具有杀伤和降解细菌作用。

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Everlab云端实验室-----吞噬细胞吞噬功能检测实验

实验概要

本文介绍了吞噬细胞吞噬功能检测（Assay of the Phagocytic Function of Phagocyte）实验的基本原理、操作步骤及注意事项等。

实验原理

吞噬细胞具有对异物(细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等)吞噬和消化的功能，在机体非特异性免疫中发挥重要作用。
小鼠腹腔内注射硫代乙醇酸钠，可刺激巨噬细胞的聚集。四日后小鼠腹腔内注入羊红细胞悬液，一小时后解剖收集腹腔吞嗜细胞，染色、镜检可观察对羊红细胞的吞嗜现象。通过计算吞嗜百分比或吞噬指数可测定吞噬细胞的吞嗜功能。

主要试剂

1. PBS 缓冲液
2. 3％硫代乙醇酸钠
3. 1％羊红细胞悬液

4. 瑞氏染液

5. 甲醇

主要设备

1. 解剖器材

2. 注射器

3. 尖吸管

4. 橡皮吸头

5. 小试管

6. 载玻片

实验材料

ICR 小鼠

实验步骤

1. 实验准备：用无菌注射器吸取3％硫代乙醇酸钠3ml，注射于小鼠腹腔内。
2. 四日后，注射1％羊红细胞悬液1ml 于小鼠腹腔内。
3. 注射1 小时后，将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖暴露腹腔，于腹腔靠上部位，用镊子轻轻夹起腹膜，将腹膜剪一小口，用尖吸管注入5ml 预温的PBS，同时用手反复揉搓腹腔约1—2 分钟，以便尽可能多地冲洗出小鼠腹腔的吞噬细胞。
4. 用尖吸管吸取腹腔液，置一洁净试管内。
5. 用尖吸管将腹腔液吹打均匀(尽量避免产生气泡)，吸取一滴滴于载玻片上，加盖玻片镜检。
6. 观察结果，也可以将腹腔液涂片，平放于湿盘内，37℃，孵育30 分钟。取出涂片，用预温的PBS 冲洗3 次，然后用甲醇固定1 分钟，以瑞氏染液1 份加pH6.4 的PBS 2 份混匀后，滴于涂片上染色5-10 分钟，以蒸馏水冲洗（切勿先将染液倾去）后，待干，镜检。
7. 实验结果
观察小鼠腹腔巨噬细胞和中性粒细胞对羊红细胞的吞噬现象，计算吞噬百分比，即每100 个吞噬细胞中吞噬有羊红细胞的细胞数。也可用吞噬指数表示，即将100 个吞噬细胞中所吞噬羊红细胞的总数除以100，即为吞噬指数。吞噬百分比和吞噬指数一般是平行的。

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一、中性粒细胞初步分选

试剂与耗材：人淋巴细胞分离液、RP1640、15ml离心管4支，棉球，止血带、碘伏、采血针，5mlEDTA抗凝采血管2支。1ml 枪及枪头。

分离步骤：

1. 所有试剂恢复至室温；

2. EDTA抗凝采血管收集人外周血10ml;

3. 分别将5ml外周血加入5ml人淋巴细胞分离液中（15ml离心管中进行）；注意动作轻柔缓缓加入；

4. 500g离心，30-35分钟，室温；

5. 离心后收集低带中性粒细胞，分两层，第一层为单核细胞，第二层为中性粒细胞；（若离心后分层不明显则多离心5-10分钟）

6. 将RP1640用纯水稀释为50%RP1640用于重悬中性粒细胞，恢复细胞活性。（5-10分钟）

7. 400g离心10分钟，去上清，收集中性粒细胞，重悬于RP1640中，细胞计数。

二、中性粒细胞磁珠分选

试剂耗材及设备：磁力分选器，磁柱，CD15磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液50ml，RP1640，1ml 枪及枪头，20微升枪与枪头，15ml离心管4支，细胞计数板。 步骤：

1. 制冰，保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在4-8℃内进行分选；

2. 配液磁珠分选缓冲液（50ml PBS液中含2mmol/L EDTA，0.5%BSA，PH=7.2）；

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1、 绘中性粒细胞示意图。

按自己的实验报告上画。

2、 瑞士染色为什么不能加热干燥？

避免加热干燥，否则细胞会因为受热脱水而皱缩，影响吞噬实验现象的观察。

3、 非特异性免疫的基本特征是什么？

个体出生就已经形成，作用广泛而非针对特定抗原。

4、 中性粒细胞吞噬功能检测在临床诊断中有何应用？

定量测定细胞吞噬功能，对于研究患者的免疫功能及指导临床具有意义。

5、 静脉注射时为什么不能有空气注入？

注射时若有空气注入，就会导致血管中有一段空隙，使这段血液无法运输氧气，若是这段血液是通向肺部，则会使机体窒息死掉，影响实验结果。

6、 实验动物的正确抓取与固定有何重要意义？

正确抓取与固定可以防止实验人员和实验动物免受不必要的伤害，从而获得更加正确可靠地实验结果，更加便于观察。

7、 同一种抗原可用哪些途径免疫动物？哪些途径免疫原性最强，为什么？ 途径：静脉注射，腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，皮内注射，皮肤划痕，吸入，口服等。其中皮内注射免疫的免疫应答最强，因为抗原在体内滞留时间长，作用时间也长。

8、 耳缘静脉注射因注意哪些细节？

（1）选静脉较粗而清晰处，剪掉拟采血耳缘不细毛。可以用手指弹兔耳或电灯照射兔耳，使耳部血管充盈，然后用酒精消毒。

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实验八  巨噬细胞吞噬现象的观察

一、实验原理

巨噬细胞由骨髓干细胞分化生成，然后进入血液到达各组织内，并进一步分化为各种巨噬细胞，当病原微生物或其它异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又有趋化性，能响应招引因子的招引，产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行，在接触到病原体和异物时，即伸出伪足，将之包围并内吞入胞质，形成吞噬体，继而细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡发生融合，形成吞噬性溶酶体，通过其中水解酶等作用下，将病原体杀死，消化分解，最后将不能消化的残渣排了出细胞外。

台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

二、实验步骤

1．在小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤（含台盼蓝）1ml。

2．24h后注射1%鸡红细胞悬液1ml，轻按腹部使分散。

3．20分钟后脱颈骨处死小鼠。

4．开腹取腹腔液（慎防小鼠血污染）。

5．腹腔液滴于载玻片上，盖上盖玻片。

6．显微镜观察吞噬现象。

三、实验结果

四．结果讨论

 

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四川大学

实验课程名 现代生命科学基础  课程号204138030

实验项目 人类ABO血型鉴定  实验日期2010/4/25

学   院  计算机学院  专   业  计算机科学与技术

学生姓名___黎波____  学   号  __0743041045____

年  级____2007级__  班   号  _____7304014____

指导老师_______________  成绩评定_____________

教务处制表

二〇##年 四 月 二十五 日

四川大学实验报告

计算机 学院 计算机科学与技术  专业  20##级7304014 班   组

姓名 黎波         同实验者 无    2010  年4月 25 日

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实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察

姓名：李思露

学号：131140040

一、     实验目的

1.       通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察,加深理解细胞吞噬作用的过程；

2.       了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法

二、     实验原理

吞噬作用也称为胞吞作用（cellular eating），指细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质（直径一般大于250mm）的过程。许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。不同动物来源的巨噬细胞或同一动物来源的不同巨噬细胞吞噬功能强弱不同，个体吞噬细胞的平均吞噬能力是机体非特异性免疫功能强弱的重要反映。

吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。

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