实习报告

天然产物实习报告

一、实习目的

1. 了解有关中式生产设备；

2. 了解天然产物提取的一般步骤；

3. 了解川楝素提取流程；

4. 尝试生产制备川楝素粗品，以川楝素纯品作为阳性对照，以卤虫检验杀虫效果

二、实习时间

20103年6月3日至6月7日

三、实习基地

西北农林科技大学生产实习基地

四、川楝素的结构以及生物活性

1、川楝素的结构

分子式C₃₀H₃₈O₁₁ 分子量：574.62

生物活性：

川楝素具有广泛的药理作用和杀虫活性，害虫取食和接触川楝素后，可阻断神经中枢传导，破坏中肠组织和各种解毒酶系及呼吸代谢作用，影响消化吸收，丧失对事物的味觉功能，以拒食导致害虫生长发育不正常而死亡。对菜青虫、银纹夜蛾、甘蓝夜蛾、烟青虫等多种病害昆虫具有拒食、毒杀和生长抑制作用，但对鹌鹑、家蚕、蜜蜂等非靶标生物均为低毒。因此，川楝素是一类理想的低毒高效的植物源农药。

川楝素是三萜类化合物，可以从川楝树中提取，在古代中国可以用于消化道杀虫剂和农业的杀虫剂。川楝素被作为选择性的突触前的雏形锻模和有效抗肉毒神经毒素试剂，通过阻碍神经递质释放凭借开始简化随后的抑制，川楝素最终阻挡了肌肉神经连的突触传导和中心神经元轴突的突触。尽管川楝素与肉毒菌神经毒素阻遏神经肌肉接头传递有一些相似的作用，但是川楝素在活体和体外有抗肉毒神经毒素的作用。研究表明，抗肉毒神经毒素作用是通过川楝素阻隔肉毒神经毒素与其酶解底物SNARE 蛋白的接近而实现的。川楝素可以引起多个细胞系的变异和细胞凋亡，并且抑制各种人类的癌细胞增殖。川楝素抑制多种K⁺通道，选择性促进钙离子通过L型钙离子通道流入，并由此导致细胞内Ca²⁺ 浓度([Ca²⁺]i)持续升高。川楝素对K+ 通道的抑制，对L 型Ca²⁺ 通道的易化和由之引起的[Ca²⁺]_i 升高和超载，是川楝素引发细胞分化和凋亡、抑制细胞增殖，以及川楝素产生神经递质双相变化和阻遏突触传递的机制。[1]

川楝素来源

楝科植物川楝子.果实、根皮、树皮苦楝树皮香椿.树皮。

川楝素理化性质

白色结晶粉末，熔点244～245℃(分解)。旋光度-13.1°(c=1.75，丙酮)。易溶于吡啶、丙酮、乙醇、甲醇，微溶于氯仿、苯，几乎不溶于石油醚及水。

五、实习内容

(1) 认识各个设备和管道，以及管道内的水、溶液、加热油的走向，见附图。

我们所使用的实验设备是中式设备，介于实验室到工厂之间的转换，我们所用的设备主要有提取罐（500L）、冷凝装置（蛇形结构）、回收塔、气液分离器以及加热提取器。提取罐、加热提取器以及气液分离器采用油浴加热，冷凝装置使用循环冷凝水冷却，加热油和循环冷凝水均为下进上出，提取罐和气液分离器为夹层装置，加热提取器为排管装置。另外为了使加热均匀，装置中还有循环泵，用于搅拌，同时循环泵也用于向提取罐中加入溶剂。当罐内液体沸腾后，有蒸汽上升。而提取罐上端处突然扩大变粗的部位，一方面该管道上方连接到墙外，起到排空的作用，另一方面该管道连接卧式冷凝器，该粗管道内存在泡沫器，可防止液体突然冲入冷凝器中，使蒸汽冷凝，起到缓冲作用。

(2) 了解川楝素，并对实习内容安排。

本次实习，我们是提取川楝素，川楝素的生物活性上面已经介绍，川楝素作为一种植物性农药，其特点有对人畜毒性低，低残留，与环境相容性好、无公害、对病虫具有较好的活性、不伤及天敌、作用方式独特、害虫不易产生抗药性以及原料易得制造方法简单，成本低廉等。

本次实习主要是从川楝子的核中提取川楝素，提取步骤大概是提取，浓缩，萃取，然后是将川楝素的粗品配成溶液，测试其活性。

（4）川楝素的提取

我们在6月3日上午开始了第一次提取，加入了20kg的川楝子核，并向提取罐中加入了乙醇浸泡之后再提取3h，6月3日下午进行了第二次提取，再次加入乙醇，提取2h。

加入溶剂的方式，在实习中我们总共用了两种钾溶液的方式，一种是利用虹吸原理从存放乙醇的桶中用长管直接加入提取罐中，或利用泵从存放乙醇的桶中将液体加入提取罐，另一种利用泵将乙醇从回收塔中加入提取罐。

（5）浓缩

6月4日开始进行浓缩，浓缩不能太浓，浓缩时打开加热提取器的入油和出油开关，并打开回收塔后的真空泵使系统中形成一定真空度，一段时间后，打开气液分离器的开关通气，避免真空度太大，导致气液分离器中形成的泡沫冲入冷凝装置中，浓缩时可以看到气液分离器中提取液从加热提取器中流入气液分离器中，当提取液沸腾时有少量的泡沫形成，但是，我们在浓缩过程中温度不够，不能保持沸腾。浓缩之后，将浓缩液从加热提取器之前的阀门流出。

6月5日利用1L的旋转蒸发仪进行浓缩，蒸至将乙醇全部蒸出。

（6）萃取以及浓缩

将已经浓缩过的提取液按1:1的比例分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，萃取时使用1L的分液漏斗，去浓缩液400mL和石油醚400mL，震荡，静置萃取，将上层油相用小的旋转蒸发仪进行旋蒸，将石油醚蒸出，旋转蒸发仪的温度为45℃。然后，将上述萃取所得的下层水相再取400mL的石油醚再次进行萃取和旋蒸，浓缩的浓缩液不能太浓，否则将无法倒出，将浓缩液放于烘箱中烘干，由于石油醚的沸点为40~80℃，则烘箱的温度不能太高，以防止石油醚挥发太快，并使川楝素变性。

将上述萃取所得的水相用400mL的乙酸乙酯重复上述萃取旋蒸的步骤两次，每次萃取必须保证完全萃取，所得的浓缩液为褐色，将浓缩液放入烘箱中烘干，将温度保持在100℃以下，乙酸乙酯不能洪太干，否则川楝素将变性。

将上述乙酸乙酯萃取所得的水相旋蒸，旋蒸时要小心，因为水相会产生大量泡沫，会将泡沫吸入蒸出的水中，形成倒吸，造成损失。在实习中，我们并没有完全将水蒸出，因为泡沫太大，无法将旋蒸进行到底，我们只蒸出了部分的水，然后将浓缩液放入培养皿中放入烘箱中烘干。

通过上述步骤得到石油醚提取的川楝素粗品，乙酸乙酯提取的川楝素粗品和水提取的川楝素粗品。

将上述的粗品以DMSO为溶剂配成川楝素粗品溶液进行活性测验。

（7）溶液配制与活性测试

活性测试所需的川楝素粗品溶液的浓度分别为100mg/mL、50 mg/mL、10 mg/mL，我们是先配制了1000 mg/mL的溶液，然后将其稀释，例如，若配制100 mg/mL的川楝素粗品的溶液，则可以加入20μL的1000 mg/mL的溶液，再补加180μL的含有海虾的人工海水。以下是1000 mg/mL的粗品溶液的配制：

(注：因为水相所得的粗品难容于DMSO中，所以多加了200μL，另外，在配制溶液时，粘度可能较大，可以用超声振动使其溶解。)

活性测试：活性测试用的是96孔板，每个孔放溶液200μL。下面是96孔板所加川楝素粗品1000mg/mL溶液的体积：（单位：μL）

（所加的人工海水为200μL—所加的粗品体积）

在恒温烘箱中培养24h后，海虾的存活量如下表格：

（D和E为阳性对照，阳性对照的溶液有老师提供浓度为500mg/mL。）

六、结果计算

死亡率计算

样品死亡率=死亡数/总数

校正死亡率=*100%（A：样品死亡率， Ck空白死亡率）

由于所配制的川楝素粗品浓度太大，而且每个孔洞海虾样品太少，所以得到的致死率为100%。

七、实习总结：

此次实习我们认识了天然产物提取的中式提取设备，也学习了有关天然产物的一般提取步骤，通过这次实习不仅认识了中式生产设备，而且也复习了旋转蒸发仪分液漏斗等仪器的使用。

在实验中，石油醚和乙酸乙酯萃取的川楝素粗品较容易溶于DMSO，但是水相中的川楝素粗品难溶，我们配制时，配制的粗品溶液的浓度为717.91mg/mL但是在96孔板中保持川楝素粗品的浓度不变，所以其中的DMSO的浓度比其它孔洞中高，

通过极性分析，乙酸乙酯应该萃取最多的川楝素，但是由于实验时所配制的溶液浓度太大，所以致死率几乎都为100%。本次试验未能验证此结论。

八、参考文献

[1] Shi Y, Li M. Biological effects of toosendanin, a triterpenoid extracted from Chinese traditional medicine[J]. Progress in Neurobiology, 2007, 1(82):1-10.