1、PCR扩增试验原理：利用特异的引物，以重组质粒pGEX-4T-1〔His〕6-C-X为模板扩增X基因。n扩增反应1〕扩增引物2〕模板：重组质粒pGEX-4T-1〔His〕6-C-X3〕PCR反应试剂盒〔购置〕4〕50×TAE缓冲液：242gTris碱57.1ml冰醋酸100ml0.5MEDTAH2O补充至1000ml5〕6×凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖，4℃保存6〕溴化乙锭保存液：10mg／ml，避光保存7〕0.8％琼脂糖凝胶：0.8克琼脂糖加热溶于100ml1×TAE。1.材料

2、n1)按以下次序，将各成分在0.5ml灭菌离心管内混合：(100ul)ddH2O79ul10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物，2ul(终浓度为0.2mmol／L)MgCl26ul(终浓度为1.5mmol／L)引物11ul(终浓度为50pmmol／L)引物21ul(终浓度为50pmmol／L)模板DNA1ul2)100℃加热反应混合液10分钟，冰浴5′，使DNA完全变性。3)将1ulTaqDNA聚合酶(5单位/ul)，加入反应混合液中。4)用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发

3、。2.操作步骤n5〕按以下方法进行PCR反应：常用循环参数：①变性：94℃1分钟、②退火：55℃1分钟、③延长：72℃1分30个循环。6)制备1.5％琼脂糖凝胶板：将1.5％琼脂糖凝胶置微波炉中溶化,稍等冷却，倒入制胶槽中，充分凝固后拔出样品梳；7)将凝胶板放人电泳槽，加入1×TAE缓冲液，使液面略高于凝胶。8)从反应混合液中取出DNA扩增产物2ul并加1ul6×凝胶加样缓冲液，混匀后全部加入凝胶板的样品孔中进行电泳。9)电泳100V约1小时；10)在500ml水中加入溴化乙锭保存液,(EB终浓度0.5-1ug/ml)

4、,混匀；11)将疑胶轻轻滑入染色液，染色20-30分钟；12)取出凝胶，用水稍漂洗；13)紫外灯下确定DNA区带。n由于PCR能够使DNA分子大量扩增，所以应当留意防止反应体系被痕量DNA模板污染(Kwok和Higuchi，1989)。尤其在待扩增靶序列浓度低的状况下，更有必要实行防范措施。留意事项n1)在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR试剂和进行反应。不用时应打开紫外灯。工作台内应配置有PCR专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他必需品。自动移液器的管部是常见的污染源，配液和移液时应当使用一次性吸头和活

5、塞的正向排液式移液器。全部缓冲液、吸头和离心管使用前必需经过高压处理。2)预备成套试剂，分装为小份，在靠近工作台的冰箱中设立特地位置来保存。配制试剂时，用从未接触过任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后将这一小份全部废弃，不得重新置存。n3)装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微量离心机上作瞬时离心(10秒)。使液体沉积于管底，削减污染的机会。4)加完全部其他反应成分、包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA。模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻弹击管侧壁，混匀液体。再作

6、瞬时离心(10秒)，使水相和有机相分开。n5)将模板DNA加入PCR系统时，留意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应。并非即用管都应盖严。拿过模板DNA管后应更换手套。6)应设置阳性对比反应(即由少量适当的靶序列参加的PCR)。对靶序列的稀释工作应于试验前在试验室内别的位置进行，防止将靶DNA的浓溶液带到试验室中特地进行PCR的位置。7)必需设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中全部其他成分的对比反应，这一对比管须在预备好全部其他PCR以后才进行吸加。附PCR试验动画