实验室质控

  第五部分目录

    胚胎实验室手册

胚胎实验室工作规程                                    1

无菌技术                                              2

设备校准和维护                                        3

实验室质控                                             5

实验室工作流程                                        6

培养液的配置                                          7

取精和精液分析                                        8

精子处理                                              9

精子冷冻和解冻                                       10

取卵和卵子处理                                       10

IVF的授精                                            11

单精子卵胞浆内注射(ICSI)                             13

胚胎的培养和观察                                     13

囊胚培养                                             14

胚胎移植                                             15

胚胎冷冻和解冻                                       17

辅助孵化                         19

胚胎着床前诊断(PGD)操作                  19

实验室人员的职业安全                     20

病人身份和标本标识                      21

实验室记录及保密                    21

冻存标本                        22

卵子的捐赠                       22

事故和问题                       22

耗材和管理                       23

设备清单                        23

消耗品清单                       24

试剂清单                        25

手术、实验室温度、湿度、通风              25

胚胎实验室工作制度

实验室人员职责                     27

实验室人员工作制度                   27

实验室物品管理制度                                        28

实验室仪器维护制度                                         28

实验室消毒隔离制度                                         28

实验室工作程序                                                   29        

                                  

第一部分  实验室质控

实验室质控是辅助生殖技术成功的关键。水、培养液、一次性用品、PVP、试剂、矿物油、混合气体的质量和实验室环境的改变可导致配子和胚胎的发育能力降低。

质控应能在问题出现之前检测出潜在的问题,当检测到问题时应立即采取措施进行纠正。程序和消耗品在没有评估和权威认可时不能随意更改。

一、无菌技术

无菌环境对任何细胞培养的成功都是至关重要的。通常采用的方式是使用垂直层流的超净工作台。工作原理:无菌气流的方向为由上而下的。位于无菌气流中的无菌物品可保持无菌,其上方无其他物体的遮盖。

操作要点:

²  确定无菌和非无菌物,分开放置,不将非无菌物放在无菌物上方

²  无菌物应暴露在无菌空气中

²  所有无菌操作必须在无菌环境中完成

²  移液时不要过早打开盖子,将盖子放在工作台的后方,内面朝上,并避免在其上方操作

²  所有移液管、移液头的前端均不可置于操净台外,应朝向内放置

²  每天工作结束后用消毒蒸馏水擦拭超净台

二、设备校准和维护

1. 常规检查和校准

2.要求:

ü  每日晨同一时间用标准的C02检测仪、温度计来检测C02培养箱内的温度C02浓度。

ü  温度和CO2浓度超出设定的界限应向上级汇报,及时处理。

ü  每日结果记录在质控记录本

3. 一般维护

建有专项记录,每次清洁维护予以记录。

4. 具体清洁消毒方法

4.1时间安排:

    每天    清洁倒置显微镜、体视镜、超净工作台、工作区域

    每周    清洁C02培养箱的水托盘,换水

    每月    清洁消毒离心机、恒温平台、恒温试管架、清洁培养箱

4.2 清洁方法:

4.2.1 超净工作台:用消毒蒸馏水擦洗表面后擦干

4.2.2 倒置显微镜、体视镜:用消毒蒸馏水擦洗表面后擦干

4.2.3 C02培养箱水托盘:把培养箱内物品拿出后取出托盘把水到掉,用沸水冲洗浸泡后用无菌纱布擦干,放回培养箱,倒入无菌蒸馏水至3/4处,待温度和CO2浓度平衡后使用

4.2.4 离心机:将吊桶从转轴中取出,用洗洁精刷洗后在流水下冲净后用75%酒精擦拭。用洗洁精、水、75%酒精依次擦洗.后重新装回吊桶

4.2.5  恒温平台与恒温试管架:从实验室取出,依次用水、75%酒精、水擦洗,试管架内管用长棉签擦拭,放回室内,装好

4.2.6  试管架:浸泡在洗洁精溶液中用刷子擦洗,在水龙头下冲洗,用75%酒精擦拭后置于通风处下燥

4.2.7  CO2培养箱:把箱内物品取出后拆除内部所有隔板,用沸水冲洗水托盘和隔板后用无菌纱布擦干。用无菌蒸馏水擦拭培养箱内壁及玻璃      门。将水托盘放回培养箱,倒入新鲜的无菌蒸馏水,将隔扳重新放回培养箱内,待温度和C02浓度达到平衡后使用

4.2.8  各种硅胶管:用酒精浸泡30分钟,用无菌蒸馏水内外冲洗20秒,用无菌蒸馏水浸泡过夜后再用无菌蒸馏水内外冲洗20秒,将管腔内的水      分排干。

5. 剥离管和移液管的准备和消毒

用经过灭菌和鼠胚实验合格的巴氏吸管。两手握住巴氏吸管的两端,将吸管窄部中央在酒精灯的火焰中烧软,移离火焰后迅速向两边牵拉,形成细长的玻璃管。用火焰将细管在合适直径处烧断,将弃去的断头在火上烧热,在留下的玻璃管中选择合适直径处烫断。在体视镜下检查其直径应为140—160um(剥离管)或160—180um(转移管)。

三、C02的检测和消耗品检测

方  法:精子存活实验

用  物:被检测过的培养液和矿物油消耗品,有来自以前受试供者的精液

准  备:收集实验当天的精液,液化后用梯度法洗涤后放在无菌离心管中。

C02监测:每个培养箱中各放两个精子培养管,并将培养管盖子松开,培养三天.

新消耗品检测:将新消耗品在适量的培养液中充分暴露,用此培养液与培养器皿收集和培养精子三天。

取  样:用移液管混合标本30次后取20ul精子放入载玻片,在镜下观察,计数200条精子的活力后除2即为最后结果,同一标本重复计数的误差应在±10%之内。

记  数:记录精子最初的浓度、活动力和活动分级,记数培养后精子的活动力和活动分级。

结  果:在第三天精子活动率减少20%以上提示有毒性物质存在。临界结果需重新测试。

实验室定期评估

当发现妊娠率下降时,应检测一些潜在可能影响因素,发现后予以纠正。

可能的影响’

1.   临床改变

2.   空气质量

3.   实验室清洁工作

4.   气体供给和气体质量

5.   实验耗材批号改变:矿物油

6.   培养箱的校准和稳定性

7.   消耗品的改变

          

实验室工作流程

上  午

·打开设备电源,开启恒温设备

·检查C02气体,C02培养箱的温度和C02浓度,并记录

·观察室内温湿度并记录

·准备当日的培养液和消耗品

·检查前一日的IVF或ICSI受精情况

·检查受精卵的发育情况

·取卵,精液处理

·IVF或ICSI

下  午

 ·胚胎冷冻

 ·配置培养液

·准备消耗品

·将第二天所需的培养皿放入C02培养箱

·关掉设备电源

·清洁设备、工作区域

·取换垃圾桶

· 关闭实验室不用的电源

培养液的配制

·  取卵液(HTF—HEPES+HAP):用于冲洗取卵针、收集卵子。

  含97%HTF—HEPES、3%HAS、1‰肝素。

·  洗卵液(HTF HEPES):用于卵丘复合物和卵子的暂时存放。

  含97%HTF—HEPES、3%HSA。

· 移植液(ET):用于胚胎移植和注射、打孔盘的制作。

  含90%ttTP—HEPES、I0%HSA。

·  培养液(IVC—ONE):用于卵子、配子及卵裂球的培养。

  含85 -90%IVC—ONE、15一I0%HSA。

·  囊胚培养液([VC‘FHREE):用于胚胎囊胚期的培养。

  含85-90%IVC THREE、15一I0%HSA。

·  80%分层油:用于精液的洗涤处理。含80%分层油、20%沈卵液。

·  40%分层油:用于精液的洗涤处理。含40%分层油、60%取卵液。

·  透明质酸酶(HY)

    HY的终浓度为80—100IU/ML

        称量0.026g的透明质酸酶溶于10ml新鲜配置的洗卵液,用0.4Sum的针筒式过滤器过滤后,每2.5m1分装于5ml的试管中,冷冻保存。

·  聚碘维酮(PVP)

    PVP的终浓度为10%

        称量0.5g的聚碘维酮溶于5ml新鲜配置的洗卵液,在室温下静置4小时后用0.4Sum的针筒式过滤器过滤,每0.4m1分装在1ml的离心管中,冷冻保存。

·  培养油的制备

        目前我中心所用的培养油是SIGMA公司的M8410矿物油。此类矿物油已经过灭菌消毒,但用前还要经过处理。

洗油:将矿物油和HTF—HEPES按9:l的比例倒入玻璃质的无菌容器中,摇动瓶子,使液体与油充分混匀。静置于冰箱保鲜层内3天(最长不可超过7灭),使油与液体自然分层。

滤油:自然分层后,将上层油置用0.45um针筒式过滤器过滤在250ml或600ml培养瓶中,置于冰箱保鲜层中保存。

平衡:用时须至少提前3天分装于50ml培养瓶中,松开瓶盖置于于C02培养箱中,平衡后方可使用。

取精和精液分析

·  取精应在取卵于术前(1CSI、IVF)或授精的(IUI)1-2小时进行。

·  核对病人姓名、病历、身份证后给病人一个取精杯,杯身上要有明确标示。

·  如取精困难,则通知男科医生,考虑通过外科手术睾丸取精。

·  尽量要求病人在中心取精,在外取精者需在30分钟内送回。

 精液分析

  正常精液标本应质地均匀,呈狄白色,在室温下30分钟即呵自然液化。刖吸管吸起后会呈不连续的小滴落下;不正常的精液标本会显得过于清澈或因有红细胞而呈棕色,或任室温下放置l小时以上仍不液化,用吸管吸起后液滴会形成大丁2CM的长丝。

精液的活力分级

A级一活力良好,呈直线运动活动

B级一活动较好,活动但方向不定

C级一活动不良,动作迟缓,原地转动

D级-不活动,死精子

正常精子标准

精子处理

对于IUI和常规IVF来讲,在精液中获取足够数量的活动精子非常重要。精子处理的过程可去除精浆,从而诱导精子的获能。对于ICSI来讲,尽管只要有活动的精子就可以进行,但适量的精子处理去除精浆和杂质有利于ICSI的操作。

新鲜精子处理方法

l、梯度法

· 将80%分层油、40%分层油、洗卵液、培养液平衡至室温。

· 存15ml离心管中先后加入80%分层油和40%分层油各1m]'注意动作要轻,不要 扰乱两层的界面。

· 加入1-2ml精液。

· 离心10分钟,转速为1800—2000转/分钟(1410)。

· 小心吸出上清至沉淀上方0.5一lml处。

· 加入洗卵液3—5ml,轻轻摇匀。

· 离心5分钟,转速为800一1000转/分钟。

·  吸出全部上清液留沉淀(如准备IVF或ICSI至此即可)。

·  加入培养液至0.5ml,放入培养箱,待用。

2、上游法(略)

3、直接离心法(略)

冷冻精子处理方法

    处理方法同上精子解冻法,如为IUI用留沉淀后再加入培养液至0.5—0.8ml处,放入培养箱,待用即可。

不动精子的实验室检测技术

    目的:区分D级中的有活性的不动精子用于ICSI

办法:低渗溶液法

精子的冷冻和解冻

冷冻保护液

    采用甘油作为冷冻保护液。

冷冻方法

    ·   精液标本需在完成精液分析和精予处理后l小时内冷冻保存。

    ·  冷冻保护液预热至室温。

    ·  将精液和等量的冷冻保护液加入Falcon352059培养管内,混匀。

    ·  每0.6—0.8ml的的混合精液装入1支Nunclml冷冻管。

    ·  将冷冻管放入已标志的铝支架中置于4~C冰箱中l0分钟。

    ·  将铝支架置于液氮罐内,距液氮面10—15cm,持续10分钟。

    ·  将铝支架置于冷冻提桶中,保存于液氮罐中。

解冻方法

    · 洗卵液预热置室温。

    ·  确认患者编号、姓名等,从液氮中取出精液冷冻管,再次确认患者编号、

        姓名。

    ·  将冷冻管在室温下放置5—6分钟,同时仔细检查冷冻管足否有裂痕或液氮渗漏。

    ·  用移液器将全部精液吸入15ml离心管中。

    ·  缓慢的逐滴加入洗卵液3—5ml,每加入一滴后轻轻摇匀。

    ·  离心 5分钟,转速为1000转/分钟。

    ·  吸去上清备用。

  

取卵和卵子处理

    通常在注射HCG36小时后经阴道在B超引导下行穿刺取卵,取卵在紧邻胚胎实验室的手术室进行,卵子经穿刺吸取在Falcon 14ML试管中。

取卵准备

    1.打开各恒温板,恒温试管架和体视镜预热。

    2.将洗卵液倒入Falcon 352059皿中,多少依每人预计卵数而定,但一般在 5~l0ml 间,放入C02培养箱中平衡待用。

    3.取Falcon353002皿待用,并制作ICSI注射盘,放入C02培养箱平衡,      等待加入精子。

    4.将含有肝素的取卵液倒入Falcon352059试管中。一般每支试管中倒入

       5~2ml.

    5.将5.75英寸巴氏管2支插入黑色橡胶吸头中待用。

 

取卵步骤

    1.执行无菌操作,及时替换有污染可能的器皿。

    2.将护士置于恒温试管架中的含卵泡抽吸液的FalCOFI 352059试管中的卵泡液倒入353002中,在体视镜下寻找卵丘复合物。

    3.找到卵丘复合物后拣出,用巴氏管在当日晨制作的353037外孔中洗涤后放入内孔。

    4.如卵丘复合物有血块污染应先用1 ml无菌针头将其剥离后再拣出。

    5.如有异常抽吸液,应在手术最后再处理,并将抽吸液保留转交给手术室护士。

    6.在卵泡抽吸过程中,将所获得的卵丘复合物及时的放入取卵前一天下午制备的353037皿中,并置于培养箱中培养,一般在获得4~6个卵丘复合物中就应进行。

    7.记录取卵开始和结束时间及找到卵丘复合物的数目。

培养皿的制作

    暂时培养皿:1个,在取卵前1日下午制作,置于C02培养箱中平衡过液,用IVC—ONE倒入Falcon353037皿的内孔中,液量依预计卵子量而定,但一般不超过5ml。

    培养皿:1个,在取卵前一日下午制作,置于C02培养箱中平衡过夜,用IVC—ONE在Falc。n353037皿中作2~7个50~80ml的培养液滴,盖以矿物油。

    注射盘:1个在取卵日晨制作,置于C02培养箱中平衡待用,用移植液和PVP

在Falcon353002皿中分别制作多个液滴,盖以矿物油。

           

IVF的授精

卵子成熟度的评估

授精时间

取卵后4-6小时

授精步骤

1.   从C02培养箱中取出暂时培养皿和调整好精了密度为5×10/ml的精子制备液。

2.   用巴氏吸管将卵丘复合物放入培养皿中。

3.   用移液滴头吸取精子制备液放入培养皿中,放的过程中要始终对准卯丘复合物。

4.   在倒置显微镜下检查精子密度,每200倍视野的活动精子数应为20~40个。

5.   将培养皿放回培养箱

6.   记录卵丘复合物的数日和成熟度。

7.   次日晨用转移管将卵了拣出,在洗卵液中洗涤后放入前一日制备的353801皿中。

8.   在倒置显微镜下观察受精情况。

9.   记录卵子数目和受精情况。

         单精子卵胞浆内注射(ICSI)

显微操作糸统

    显微操作系统是NIRON—EF300粗调为手动的机械操作器,微调为操作杆倒立的液压三维显微操作器。

    显微操作系统配备恒温台,其设置温度应使ICSI注射器中的液滴保持37℃。目前我们的温台设定为38.5℃。

    显微注射针和持针内的压力由操作器控制,连接的管中充满矿物油.使整个管路中不含空气。

显微注射针

    ICSI显微注射针对于成功的ICSI是非常重要的,目前我们采用的是COOK生产的K MPIP一3330。

精子处理  (见前精子处理)

卵子的处理

    ICSI前卵子需在透明质酸酶中剥离颗粒细胞,一般在取卵后2—3小时进行。

1.   准备一个皿,分别加入透明质酸酶(HYASE)及H—HTF制成液滴

2.   用一较粗吸管将3—5枚转移到透明质酸酶中,小心谨慎地吹打卵子.卵子颗粒细胞开始脱离.在透明质酸酶中处理的时间不应超过30秒

3.   将部分裸化的卵子转移到H- HTF滴中,尽量少吸透明质酸酶液。上下吹打单个卵子,用一较细的吸管除去颗粒细胞.在另几个H-HTF滴中冲洗卵子.然后用新皿重复以上操作直至所有卵子完全裸化

ICSI过程

1.   根据有无极体,M2(有极体)、M1(无极体)及有无GV判断卵子成熟情况。将成熟卵子转移到前一天晚上制备好的ICSI微滴中。不成熟卵子(M1和(jV)可以继续培养至成熟。

2.   将1~2 ul精子悬液加到ICSI微滴的中央。孵育几分钟让精子游到液滴的边缘。

3.   装上ICSI针射针。

4.   用注射针压住精子的尾部并将其制动。因为精子颈部含有大量的中心粒,  这些中心粒在细胞分裂过程中对染色体起到重要作用,在操作过程中不伤及  颈部是其中的关键。不正确的精子尾部挤压会降低受精率。吸取精于是要先  吸取尾部。

5.   将卵子微滴移到视野中央。用固定针将卵子固定。注射带有极少量PVP的精子,注射后防止胞浆倒流进入注射针。

6.   所有的卵了注射后应放入准备好的培养液中培养。

7.   根据受精后第二天有无两个原核(2PN)及两个极体出现末判断是否受精。

胚胎的培养和观察

培养的基本原则

  ·  所采用的耗材和试剂应用无菌无热源并通过鼠胚的。

  · 有高质量的供气,稳定无菌的环境,温湿度气体浓度应稳定控制。

  ·  尽量减少胚胎操作次数,尽量减少胚胎暴露于不理想的环境中。

  受精观察

一般在授精开始后15- 18小时检查卵子是否受精,并记录每个卵了的原核,极体及其他需要记录的内容。

受精标准: 卵内有双PN,卵周隐有2个极体,卵子表现分裂迹象.一般卵裂发生较晚,约在授精后22—30小时发生第一次卵裂,正常的卵裂时间和卵裂方式才是最可靠的指标。

胚胎的观察:

           可在授精后第二天开始观察,必须在37度恒温平台倒置显微镜下进行并记录每个卵子的卵裂球数、大小、形念及有无碎片等其他需要记录的内容。

 胚胎质量的分级:  一至三级适用于移植。

    一级:卵裂球等大,均质透明,无碎片。

    二级:卵裂球不等大,均质,无碎片。

    三级:卵裂球等大,均质,有少许碎片。

    四级:卵裂球不等大,变黑,颗粒不均匀。

囊胚培养:

    此项技术主要是为了减少多胎妊娠的发生率。囊胚移植与常规情况比更符合生理情况,通过延长体外培养的时间,可白然淘汰无发育潜能的胚胎,移植的胚胎存经历了自然选择后无疑是最具有活力的。

囊胚培养操作:

1.   DAY3,检查胚胎卵裂情况,并在中午十二时至二时之问转移至IVC—Three    培养液。每个液滴最多可放4枚正常发育的胚胎。培养至DAY5做移植评分时为止。如果卵裂异常,应及时速报护士及相关医务人员

2.   DAY5,评估胚胎质量,确定能否用于移植或冷冻。囊胚移植应该与DAY2/DAY3 胚胎的移植相同。囊胚冷冻可以在DAY5时进行

3.   如果在DAY5不形成囊胚,那么这种胚胎可以继续培养一天存DAY6评估是否用于移植或冷冻。

囊胚质量评分要点:

Ø  在DAY5,大多数囊胚应当达到4AA。

Ø  为了尽量避免多胎妊娠,移植囊胚数目不得超过两枚。选择评分为3以上的囊胚。最好选择评分最高的囊胚,如-AA。

操作程序:

1.    用阿拉们数字1-6对囊胚的扩张度和孵化状念评分,用ABC字母对内细胞团(ICM)以及滋养外胚层(TROPHECTDERM)评分

2.    用解剖镜对囊胚质量进行初步评估

3.    用倒置显微镜对囊胚质量进行进一步评估。将囊胚分成3 -6级(满囊胚    以后),然后评价ICM以及TROPHECTDERM发育情况。

 评分标准:

    扩张度和孵化状念:

²  早期胚胎:囊胚腔不到整个胚胎的的一半

²  囊胚:囊胚腔超过了胚胎体积的一半

²  满囊胚:囊H11腔完全占据整个胚胎

²  扩张胚:囊胚腔体积稍大于早期胚胎,透明带逐渐变薄

²  孵化胚:TROPHECTODERM通过透明带逐渐变薄

²  孵化后囊胚:囊胚完全脱离透明带。

    ●  ICM分级

    A.包裹紧密,大量细胞。

    B.结构松散,少量细胞。

    C.极少量细胞。

    ●TROPt IECTODERM分级

    A.细胞形成紧密结合的上皮。

    B.少量细胞形成结构松散的上皮。

    C.极少量细胞。

胚胎移植

胚胎移植可在第二天至第六天进行,胚胎通过移植管经宫颈管植入宫腔。

用物

移植管:由护士准备。

移植液:新鲜配置的移植液盛于352059试管中,在恒温试管架上预热。

移植胚胎的选择

    移植胚胎的选择可以参考胚胎的分级。

1.优先选择级别高的胚胎。

2.在同有少许碎片的胚胎中选择卵裂球数目较多的胚胎。

3.在同一级别的胚胎中,优先选择原核形态发育快,有早期卵裂的胚胎。

4.不移植多个原核的胚胎。

   移植的数目基于病人年龄,周期数、胚胎质量、宫内环境以及病人的知情意愿,而定,应尽量减少移植胚胎的数量,常规移植不超过2个。

移植过程

1.   将已选择移植的胚胎集中放在培养皿的一个液滴内,放回培养箱

2.   将1个353002皿置于体视镜镜头下

3.   用lMLBO注射器吸耿0.8—1ML的移植液,滴出2—3滴于353002皿中,排尽注射器内空气,连接移植管内管和1MLBD注射器,冲洗移植管并排尽管内空气

4.   将移植管与注射器交于手术医生,待医生将外管置于宫腔后从C02培养箱中取出放有胚胎的培养皿,在体视镜下将移植胚胎放入353002液滴中,并尽量使胚胎聚在一起

5.   取回移植管内管及注射器,排出注射器内液体至刻度0.0l处,以使内管前端可能粘连的宫腔分泌物、气泡等排出

6.   将管头放入252002中胚胎所在的液滴中,轻轻逐个将胚胎吸入,最后一个吸入的胚胎要与管口留有1CM的距离

7.   注射器和管内的移植液量总和不可超过0.02ML,并保证注入宫腔的液体不多于0.01-0.015M1.,以防止过多的液体携带胚胎倒流出宫腔

8.   将吸有胚胎的移植管交于手术医生进行移植,移植结束后取回移植管,在体视镜下冲洗,检查是否有胚胎滞留

9.   如有胚胎滞留,应重复以上步骤移植

胚胎冷冻和解冻

慢速胚胎冷冻

1.取待冷冻的胚胎,在冷冻液中洗涤10分钟。

2.取胚胎冷冻保护液放入冷冻管。

3.将胚胎放入冷冻管。

4.把胚胎管放入220C温度中,先以20C/分钟的速度将胚胎管降至一70C。

5.用一100C以下的钳子夹冷冻管,使其迅速结冰。

6.再以-0.30C/分钟的速度降至一350C。

7.冻好的管子立即放入液氮的盒里之后再移入。

快速胚胎冷冻

1.写好病人的姓名、编号。

2.配置好冷冻液20%(PPD)、0.1M蔗糖。

3.胚胎放入1ml冷冻液中。

4.室温放置5分钟。

5.直接加入液氮中。

胚胎解冻

    胚胎解冻液的配置:  D4液:H- HTFll.9ml+HSA2.1m]

             0.2M蔗糖:D4液9.4ml+0.68g蔗糖

             D1液:0.2M蔗糖4.6ml+丙二醇0.4m Ji

           D2液:D1液lml+0.2M蔗糖1m]

           D3液:0.2M蔗糖+D4液lm]

解冻步骤:

  1.确认患者身份找出相应的冷冻管,并进行记录。在解冻液器皿上标上记

    号D1- D4。

  2.将冷冻管放入30℃水浴箱中2分钟。

  3.将胚胎由冷冻管中用吸管取出。

  4.将胚胎放入Dl中5分钟。

  5.将胚胎放入D2中5分钟。

  6.将胚胎放入D3中5分钟。

  7.将胚胎放入D4中5分钟。

  8.将胚胎放入IVF—ONE+10%ttAS培养液中,放入C02培养箱内培养即可。胚胎可以马上植入,也可以培养数小时或隔天植入。

要点:

· 解冻必须一次成功

·  解冻操作在室温下进行(18—20C0)

· 确认患者身份并进行记录

              辅助孵化

    辅助孵化是利用物理或化学的方法,人为的在胚胎的透明带上制造一处缺损或裂隙从而有利于胚胎的发育,增加着床的可能性。一般在DAY2或DAY3移植前进行。

化学方法

    即利用Tyrode液的酸性在胚胎的透明带上溶解出一个15—30um的小孔。

    1.准备Tyrode液和H—HTF微滴培养皿并加以平衡。

    2.将胚胎放入H¨一HTF微滴中,一枚胚胎一个微滴。

    3.将钻孔针调至Tyrode微滴中抽吸少量TYrode液,确保不漏液。

    4.固定针将胚胎固定。

   5.将针尖刺入卵子透明带0—3点间部位。用打孔针接触透明带,前后移动少许,并将少量的Tyrode液注射到透明带表面。关键是要在操作中密切注意操作细节。首先溶解透明带外层,然后溶解内层。

    6.操作中尽量使所用的Tyrode液量减到最少,不要将TYrode液喷到胚胎内,并尽快先成操作,以免胚胎在酸性环境中的时问过长。

   7.该操作过程需要2—3分钟。胚胎应在新平衡的H—HTF中冲洗,然后转移到胚胎培养液中。接下来的操作应尽可能的谨慎,以免造成卵列球丢失。

激光方法即利用瑞士FERTILASER的第二带OCTAX激光破膜系统产生的激光束在胚胎的透明带上打孔。

透明带打孔

1.   准备H—HTF微滴培养皿并加以平衡

2.   将胚胎放入H—HTF微滴中,一枚胚胎一个微滴

3.   在倒置湿微镜下观察,选择透明带清晰空隙较大、无卵裂球处用激光束打孔

4.   依透明带的厚度和韧性调节激光束的能量强度,一般在6—9之问

5.   该操作过程需要2 -3分钟。胚胎应在新平衡的H—HTF中冲洗,然后转移到胚胎培养液中。接下来的操作应尽可能的谨慎,以免造成卵裂球丢失

 胚胎着床前诊断(PGD)操作

根据不同的病因用IVF或ICSI

    高龄妇女(37岁以上),如果有染色体异常的病史或流产史,需要做PGD。可以在人工刺激排卵及取卵后,用IVF使卵子受精。如果病人来做PGD是由于遗传病,由其携带的病变基因引起的,需要直接检查原因。这种情况下,选用ICSI,目的是防止粘在透明带上的精子有DNA的污染。

受精卵的培养及取单细胞

    从取卵的当天算(当天为0),将胚胎培养到DAY3时,即受精卵分裂到8个细胞期时,就可以从中取出1-2个单细胞做诊断。取细胞是在显微镜下操作,用固定针固定胚胎,然后用激光或酸性培养液将透明带打孔,再换取细胞的针,吸取1-2个细胞。FISH(Flurosence in-situ hybridization),PCR(Polymerase chain reaction)的选择

    二者的选择是根据病人情况而定,检查染色体数目异常和结构异常(如平衡异位),选用FISH 。检查基因病变则选用PCR,对于x一连锁遗传病需做性别鉴定的,则选用FISH较简单。

FISH的操作注意或规则

1.   首先将取出的胚胎细胞固定在载玻片干后再进行脱水和去蛋白,使细胞核固定在玻片上

2.   脱水后经固定和在缓冲液中冲洗后,加上荧光标记的DNA探针,然后在370C条件下杂交

3.   杂交后,需要流掉非特异性结合的DNA探针,然后在荧光显微镜下检查细    胞核,检查结果必须有两人确定

4.   整个操作要仔细,不能将细胞核丢失。检查细胞核时,要排除假阳性信号

5.   整个操作过程要用血细胞做对照,防止因操作过程和溶液失效引起的误诊

6.   整个溶液的PH值要确定,浓度要准确,保存温度适宜。

PCR操作规则

1.   所有用具都必须严格消毒,单独分开保存,防止DNA污染

2.   操作人员必须戴无菌手套、消毒手术衣进入隔离室,隔离室内不允许带DNA    或血样本,防止交叉污染

3.   所有溶液都要先去DNA污染后才能用

4.   做PCR时,必须设阳性对照及阴性对照组,防止误诊

5.   PCR结果必须由两名检查人员同时阅读后出报告

6.   定期检查PCR仪的温度是否达到实验要求,保持所有操作用具的清洁

        因PGD是一项新的技术,可靠性不足100%,故要求病人在做完PGD怀孕后,做绒毛膜穿刺或取羊水,再次检查胎儿染色体或基因,以确诊。防止因误诊而生出有基因缺陷的孩子。

实验室人员的职业安全

安全措施

1.   参加每年度的体检

2.   操作人员应进行乙肝病毒的免疫,每五年加强一次

3.   一切体液类标本如精液,宫颈黏液或血液制品应作为潜在感染原处理

4.   处理体液标本(精液、卵泡液、血清等)必须戴一次性手套,写记录单或离开实验室时应脱去手套,脱去手套时应洗手

5.   如果裸露的手接触体液类物质,立即用清洁剂撤底清洗

6.   如果眼睛或有创伤的皮肤不小心接触血液制品,立即消毒清洗

7.   消毒衣和手套不准穿出实验室外

8.   离开实验室休息或用餐前切记洗手

9.   实验室内禁止吃东西、喝饮料、吸烟

10. 操作标准化

11. 肝炎或有其他传染病的病人的体液标本、冷冻胚胎、精子等应另行处理和保存

液氮安全处理

·  装或倒液氮时戴上安全手套

·  不要单独举起液氮罐,须两人操作

病人身份和标本标

病人的身份标识

1.   每位病人必须有明确的身份证明,其标示应是独一无二的

2.   取卵和胚胎移植时必须与病人直接核对证实病人身份

3.   如同时进行治疗的病人名字相同,必须另做标记(如病历号、年龄等)

标本的识别和处理

1.   不同病人的卵予、精子、胚胎等须分别放置于有标记的不同容器中

2.   所有容器的标示必须是清楚、详细和决不含糊的

3.   女性病人的姓名及相应的编号应标记在ICSl操作皿、培养皿、洗涤皿:,并同时标记在精液容器和精子洗涤管上

实验室记录及保密

实验室记录

1.   记录取卵过程、精液情况、授精时间、方式、受精检查、卵裂检查、移植和胚胎冷冻情况

2.   在冷冻胚胎移植周期,记录胚胎解冻情况

3.   移植后13天时进行妊娠检测并汜录结果

4.   记录精液冷冻和解冻的情况

保密

²  病人允许进入实验室

²  未经允许非工作人员不得进入实验室

²  实验室钥匙专人保管、专人负责,不得借给他人,离开科室时上交负责

²  所有病人的实验室记录必须保密

●  完成一天工作后记住锁门

    冻存标本

·  通知病人有天冷冻储存情况及所须费用

·  胚胎冷冻保存期限为半年,在病人的要求下可以延长

·  在胚胎冷冻保存期内,每半年应向病人说明胚胎冷冻情况,并

  要求交纳每年的冷冻费用

·  病人有权在任何时候要求丢弃其本人的冷冻胚胎

·  丢弃胚胎(志愿或到期未延长者):约每半年清理相关文件和选择

·  需要被丢弃的胚胎,从液氮中取出,由两个工作人员核对证实后

    方能丢弃

·  填写记录单,加入病人的冷冻记录

               卵子的捐赠

    周期病人可自愿将多余卵子提供给其他需要卵子的病人;需要卵子的病人可以寻找亲友或自愿者提供卵子;本中心不参与卵子的捐赠。

    ·  供者和受者存卵子捐赠或接受协议上分别签字并经公证处

    公证

    ·  来自一个人的卵子原则上只有单一受者

    ·  供者和受者的移植时间尽量避开

    ·  与国家有关规定冲突的应依照国家有关规定执行

             事故和问题

事故

· 丢失精液、卵子、胚胎

· 授精标本错误

· 移植时胚胎错误

问题

· 违反实验室安全规则

·  找卵时未发现卵子及时通知临床医生

·  卵子错过授精或ICSl时问

·  <50%受精率或完全受精失败

·胚胎发育差、碎片,移植前通知临床医生

·  技术和设备上的问题及时报告负责人处理

· 记录并提供事件的详细资料交与负责人

· 负责人根据情况解决问题

·事故应在室内例会上报告、讨论

         耗材和管理

    本中心lCSI和IVF中需要大量消耗品,它们各有不同的保质期,且有批间差异,这些会影响ICSI和IVF的结果。因此要记录下各种消耗品的批号

选择

·采用无菌无热源经过鼠胚检测的消耗品和试剂

·采用已获得良好临床结果的消耗品,更换试剂要做有效的对比试验

·试剂类要注意其有效期、到货时间、运输等因素管理

·应有专门的储臧室

·有符合保存试剂温度的专用冰箱

· 有记录每种消耗品用量库存的记录本

· 有消耗品订货、到货、出货门期、批号、数量、有效期的专用记录本

· 首先使用有效期较近的消耗品

·每一个月盘点、校对库存数量

· 过期试剂消耗品丢弃不用

设备清单

            

          消耗品清单

试剂清单

      手术、实验室温度、湿度、通风

    本中心手术、实验室的温度和通风通过独立的一套空气净化系统来完成。除必要的空气流通管道外,本系统主要由3大体组成:空调、加湿器、风机。

空调

    作用:控制室内温度的增减

    使用:于每日晨开始工作前开机。在空调机的控制面板上有

    清楚的标识,按一下“开’’即可,并按上下键把温度调

    到适用档,同样按“风速’’把风速调到“高”、"中”、“低”。

    每日工作结束后关机,按“关”即可。

    温度:实验室的温度调为“26摄氏度”,风速“高档”;手术室

    调为“26摄氏度”,“中档’’即可。在使用中依需要可再调整.

    时间:当刚开机时,30分钟后可达到预定温度,如中途凋整温

    度,一般增减2摄氏度需用时10分钟左右。

    注意:每日观察室内温度记是否与所调温度相符。如有不符,查明原因并调整正常。当室外温度过高或过低时可出现温度小符的情况,可适当 调低或调高温度。

  清洁保养:每日工作结束后擦试机身表面。每月末清理机内滤网一次。清理时将滤网卸下用干毛刷轻轻扫去灰尘。

加湿器

    作用:控制室内湿度的大小

    使用:于每日晨开始工作前开机。开关位于加湿器的左侧壁,按“开”即可,并使用左前壁上的旋钮将指针调到预定湿度。每日工作结束后关机,按“关”即可。

    湿度:三台加湿器的旋钮均调到“40—45”之问即可,在使用中度需要可再调整。

    注意:每日观察室内湿度计显示是否与预定值相符,如有不符,查明原因并调整正常。加湿器在室内湿度正常时,会停止喷雾暂停工作,当室内湿度低于预定值时,则会自动开启开始喷雾。

 清洁保养:每日工作结束后擦拭机身表面。每周末清理机内轮盘和水槽。机内如存有水垢,用抹布用力擦沈或用软刷刷洗即可去除;如水垢较厚重可用奇力洁等去垢产品,但清洁后必须用清水冲净残留洗剂通风去味后方可安装使用。水槽内的存水每周换补一次,将放水管打开3—5分钟即可;加湿器如不经常使用时,可两周清洗换水一次,如长时间不使用时则将水槽内的水放净,将机内擦干。

风机

 作用:控制室内的进出风速和风量。实现手术室和实验室的层流与无菌。

 使用:于每日1晨开始工作前开机。风机按纽位于墙上,并有标签指示。按开即可,此时绿灯亮起。每日工作结束 后关机,按关即可。

 压力:当三台风机都打开时,观察室内压力表。从高到低依次为实验室、大手术室、小手术室、外走廊。

 注意:每日观察室内压力表是否正常,如有不符需查明原因并调整正常。如当压力表显示过低时为进风通道受阻;当压力表显示过高时则为回风通道受阻。

 清洁保养:每日工作结束后,擦拭机身。每月末清理机内与风口处滤网一次。清理时将滤网卸下用干毛刷轻轻扫去灰尘。如灰尘较多时也可用洗尘器清理或

将网芯拆下用清水刷洗。每年更换滤网一次。

空气流通管道

    一般不需特别维护,每年将全部进出风口处的滤网更换一次。

另:实验室的整套系统一般不关机,但每日工作结束后,可将温度、风速等调低,于次日工作前再调回。因手术、实验室对空气质量要求很高,所以,各机房必须保持清沽无尘,每日工作结束擦拭机身后,同时清洁机房墙面与地面。

    实验室人员职责

一、在本室负责人的领导下,实施室内的助孕.检验.科研工作

二.制定工作计划,组织实施,定期总结汇报.

三、认真执行各项规章制度和各项技术操作规程.做好登记.统计和消毒隔离工作

正确使用试剂.药品.培养液和器材.设备并做好登记.认真的做好审查药品.器

材的请领.报销工作.经常检查安全措施,严防差错事故

四.参加室内工作,监测.保持工作质量,开展质量监控工作

五、与临床保持密切联系,不断总结,提高工作质量

    实验室人员工作制度

一、使实验室保持整洁,禁止在室内进食,每日工作完毕及时清理室内卫生,清洁消毒实验室

二、工作人员进室需更换衣裤.鞋子,并洗手戴帽子,不得使用化妆品,定期进行健康检查.

三、按规程做好无菌操作及消毒隔离,保证一人一针一管一盘,用过的一次性用物及污染物要在消毒处理后送焚烧

四.定期检佥.记录各种耗材.试剂的储量和仪器设备的工作状态,发现问题及时申报请领或检修.

五、下班前常规检查水电门窗,保证安全

    实验室物品管理制度

一.试剂有专人.专地保管,严格执行请领制度.

二、试剂名称与标签必须仔细核对,注意批号与有效期,过期者妥善处理.使用试剂更换批号时,必须做对比试验,无误后方可使用.

三.易燃易爆物品远离火源,巨毒试剂有专人专柜保管,使用登记.

四.贵重仪器专人保管,定期维修登记,如有损坏及时报告主管人员.

五、试剂物品运到时要入库登记,每天清点所用物品,定期与负责人核对物品.

    实验室仪器维护制度

一、恒温培养箱.冰箱内外清洁.培养箱内温度上下波动不超过1 0C:水盘内水位适宜冰箱内温度定期观察登记.

二、离心机外观清洁,内部无积尘,安放平稳,转动时不振摇.

三、操净台内外清洁,菌培达标:加热台电路正常,清洁干燥,温度显示无偏差.

四、光学显微镜机械部分清洁无尘,无油腻,各种螺旋功能良好,光学部分清晰无霉无油渍,非使用时间有罩防尘.

五、各种工作一起使用人责任明确,定期维护检修,交班时有交接记录.

    实验室消毒隔离制度

所有污染的废弃物品均应与生活废弃物分开处理,装在黄色垃圾袋中,并贴有明显标识.依照医院废弃物处理方法妥善处理.如订污染悱物质洒于桌面或地面,立即用清水擦拭,工作结束后用消毒液再次擦洗污染区,在通风换气.工作服更换,并用高压蒸气消毒灭菌.

 如有传染性物质误入口]中,立即吐出,用0.18/L的K2MN04或1%过氧化氢溶液多次漱口必要时使用抗生素.

如有手被污染,用0.1%一0.2%过氧乙酸溶液或含氯消毒剂内浸泡2分钟用肥皂与清水洗净.

每月:清洁消毒C02培养箱

每周:清盘,清点库存,及时申领或订购

实验室工作程序

每日:配制试剂,准备次日用品:做好工作汜录,检查调试仪器:清沽室内卫生

每曰工作程序

1.通风换气:开机预热.

2.准备物品.试剂.

3.查看记录胚胎发育情况.

4检查调试仪器,清沽室内卫生,准备胚胎

5.准备次日用物.

6.整理标本,做工作记录

7.关闭仪器,清洁卫生

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