分子生物学实验 实验报告

分子生物学实验


目录

1.P38质粒提取及蓝白斑筛选和Southern杂交实验... 4

1.1实验目的和原理:... 4

1.1.1学习碱裂解法提取质粒的原理... 4

1.1.2 掌握蓝白斑筛选的实验方法及原理... 4

1.1.3地高辛标记的Southern杂交... 4

1.2实验材料及实验仪器:... 5

1.2.1 质粒提取... 5

1.2.2蓝白斑筛选... 5

1.2.3地高辛标记的Southern杂交... 5

1.3 实验步骤... 6

1.3.1 质粒提取... 6

1.3.2蓝白斑筛选... 7

1.3.3地高辛标记的Southern杂交... 8

1.4实验结果及分析:... 10

1.4.1 质粒PCR结果... 10

1.4.2 质粒酶切结果... 10

1.4.3蓝白斑筛选实验结果... 11

蓝白斑筛选后菌落PCR结果... 11

1.4.4 Southern杂交实验结果分析... 12

2. GFP质粒提取转化及绿色荧光观察实验... 13

2.1实验目的和原理... 13

2.1.1 GFP质粒提取及转化同实验一中P38 质粒的提取及转化... 13

2.1.2阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达... 13

2.2 实验材料及实验仪器(阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达)... 13

2.3 实验步骤... 14

2.3.1Arabinose诱导GFP表达... 14

2.4实验结果及分析:... 14

3.植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析... 15

3.1 实验目的及实验原理... 15

3.2 实验材料及实验仪器(植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析)... 15

3.3 实验步骤... 16

3.3.1基因组DNA提取... 16

3.3.2酶切及电泳分析... 16

3.4实验结果及分析... 17

3.4.1小麦基因组提取电泳检测... 17

4. RT-PCR并与基因组DNA PCR对比实验... 18

4.1 实验目的和原理... 18

4.1.1 RNA的提取... 18

4.1.2 RT-PCR扩增目的基因DNA.. 18

4.2 实验材料及试验仪器... 19

4.2.1 RNA的提取... 19

4.2.2 RT-PCR扩增目的基因DNA.. 19

4.3 实验步骤... 20

4.3.1 小麦RNA的提取... 20

4.3.2 RT-PCR扩增目的基因DNA.. 20

4.4实验结果及分析... 21

4.4.1提取RNA电泳检测结果... 21

4.4.2 RT-PCR电泳检测结果... 21

4.4.3 RT-PCR并与基因组DNA PCR对比... 22

总体实验总结... 22

 

1.P38质粒提取及蓝白斑筛选和Southern杂交实验

1.1实验目的和原理:

1.1.1学习碱裂解法提取质粒的原理

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。目前,经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。

质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小,且具有超螺旋共价闭合环状的特点,从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有:碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理:利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋解开而变性,质粒DNA氢键也大部分断裂,双螺旋也有部分解开,但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的致密网状结构,离心后,由于浮力密度不同,染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

1.1.2 掌握蓝白斑筛选的实验方法及原理

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法: 是根据载体的遗传特征筛选重组子,如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框,但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能,这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性,但它们同时存在时,可形成具有酶学活性的蛋白质。这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落,因而易于识别。然而,当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选,又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后,有重组质粒的细菌形成白色菌落。

1.1.3地高辛标记的Southern杂交

地高辛随机引物法标记的原理:在随机引物法标记的反应液中,有随机合成的六聚核苷酸作为引物,dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物,以单链DNA作为模板,在Klenow酶的作用下,合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后,再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测,就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统,BClP/NBT显色,敏感性很高。

实验流程图:

1.2实验材料及实验仪器:

1.2.1 质粒提取

(一)实验材料

含质粒的大肠杆菌DH5α

(二)试剂

1. LB液体培养基:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,溶解于1000mL蒸馏水中,用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。

2. LB平板培养基:在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂,高压灭菌20分钟。

(三)仪器

1. Eppendorf管、离心管架

2. 10,100,1000μl微量加样器

3. 台式高速离心机

4. 摇床、高压灭菌锅

1.2.2蓝白斑筛选

(一)实验材料

连接好的TA克隆样品、感受态细胞、

(二)试剂

30 μL X-gal、 IPTG、氨苄

(三)仪器

1. PCR机

2.LB培养基(液体、固体)

3.离心机

1.2.3地高辛标记的Southern杂交

(一)试剂

1. DIG Random Labeling Mix(高效)

2. Anti-DIG-AP Conjugate

3. BCIP/NBT Stock Solution

4. Blocking Reagent

5. 20×SSC:0.3M 柠檬酸钠,3M NaCl

6. 2×SSC:0.03M 柠檬酸钠,0.3M NaCl

7. 0.2M  EDTA

8. 变性液:0.5N NaOH,1.5M NaCl

9. 中和度:0.5M Tris-HCl,pH7.4,3M NaCl

10. Standard buffer:

 5×SSC,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 0.02% (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent。

11. Standard buffer+50% formamide

  12.  Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体

    13.  BCIP/NBT储备液:

14. 冲洗液:0. 1M Tris-HCl,0.15 M NaCl. pH=7.5.

15. 封闭液:1%Blocking Reagent/ 0.1M Tris-HCl,0.15M NaCl.

16. 显色缓冲液:0.1mM Tris-HCl,0.1M NaCl,pH=9.5.

17. TE缓冲液:10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0

(二)仪器

1. 台式离心机

2. 恒温水浴

3. 白磁盘

4. 杂交炉

5. 电泳系统

6. 硝酸纤维素膜或尼龙膜

7. 封口机

1.3 实验步骤

1.3.1 质粒提取

1.3.1.1培养细菌

将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上,37℃培养24小时,然后从平板上挑取单菌落,接种于5ml液体培养基中,37℃培养12小时。

1.3.1.2 提取步骤

1.         柱平衡步骤:向吸附柱CP3 中(吸附柱放入收集管中)加入500μL 的平衡液BL,12,000rpm(~13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)

2.         取1-5 mL 过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机,12,000rpm(~13,400×g)离心1min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

3.         向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL 溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),

4.         使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

5.         向离心管中加入250μL 溶液P2,温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。

6.         向离心管中加入350μL 溶液P3,立即温和地上下翻转6-8 次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心10min,此时在离心管底部形成沉淀。

7.         将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3 中(吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心30-60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3 放入收集管中。

8.         向吸附柱CP3 中加入600μL 漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3 放入收集管中。

9.         重复操作步骤7。

10.     将吸附柱CP3 放入收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

11.     将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50-100μL 洗脱缓冲液EB,室温放置2 min,12,000rpm(~13,400×g)离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。

1.3.1.3 琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA

1.3.2蓝白斑筛选

1.3.2.1 质粒PCR扩增

1.按下表加入试剂,并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒DNA。

2.设置PCR程序:

                94 ℃         180s          

                94 ℃         45s

   32 cycles:     55℃          45s

                72 ℃         45s               

                72 ℃         600s

3.运行PCR程序

 (二)PCR产物鉴定

反应结束后,取20μl PCR产物进行1.2% 琼脂糖电泳分析。

1.3.2.2 制备大肠杆菌感受态细胞

1)        从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素),37℃×200rpm×12-16h,可过夜培养。

2)        将活化菌体按1~5%接种到LB中,扩大培养37℃×200rpm×2h,至OD600约为0.4。

3)        取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中,4℃ 离心10000rpm×1 min。

4)        弃上清,加800 μL 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体,4℃冷冻离心3500rpm×5min。

5)        弃上清,加400 μL 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体,4℃冷冻离心3500rpm×5min。

6)        彻底除去残液, 加400 μL 0.1M CaCl2 (灭菌预冷),悬浮菌体,离心3500rpm×5min。

7)        冰浴静置30 min。

8)        弃上清,加100 μL 0.1M CaCl2 (灭菌预冷),悬浮菌体,即为制备好的感受态细胞。

1.3.2.3 PCR产物导入感受态细胞

1)        将连接产物加入100 μL制备好的感受态细胞,冰上放置30 min。

2)        42℃热激90s。

3)        迅速冰浴3min。

4)        加入600 μL LB液体培养基,37℃轻摇培养45min。

5)        30 μL X-gal和6 μL IPTG混匀涂布在含有50 μg/ml氨苄的LB固体培养平板中。

6)        取菌液100 μL涂板。

7)        37℃倒置,避光培养16-20 h。

1.3.2.4 将细胞进行培养且在培养基中加入amp,IPTG以及X-Gal

1.3.2.5 蓝白斑筛选并进行菌落PCR

1)        直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入25μL或50μL PCR反应体系中。

2)        用通用引物或特异引物进行PCR,根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向(反应体系参照前面实验)。

1.3.3地高辛标记的Southern杂交

1.3.3.1探针的标记

1.用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。

2. DNA热变性:把DNA置于沸水中,水浴10分钟。然后,迅速地插入碎冰中3分钟以上。

3. 加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再2000RPM离心 5分钟。

4. 置于37℃反应至少120分钟。时间越长,产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。

5. 加入2μl EDTA以终止反应,对于原位杂交和膜反应杂交来说,标记反应可告结束,上述反应液置于-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。

可根据下表估计标记产量:单位(ng)

1.3.3.2 Southern转移

1. 将目的基因经琼脂糖凝胶电泳的胶板从电泳槽中取出,凝胶浸入0.25M HCl 中10分钟。HCl处理的作用主要是通过嘌呤使DNA分子断裂,因而有利于高分子量DNA的转移,但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb的DNA片段时可省略此步骤。

2. 进入变性液之前,用蒸馏水漂洗20-30分钟。

3. 把凝胶浸入变性液中,室温浸泡15分钟×2次。

4. 蒸馏水漂洗凝胶2次。

5. 把凝胶浸入中和液中,室温浸泡15分钟×2次。

6. 处理凝胶的同时,切一张同样大小的尼龙膜或者硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜用2×SSC 浸泡。剪两张Whatman3#滤纸和吸水用的粗滤纸。(注意不要用手直接触及膜面)

7. 准备转移用平器和支架,平器中放20×SSC。支架上搭滤纸桥使得溶液能够虹吸上来。

8. 依次放:处理好的凝胶,硝酸纤维素膜,吸水纸,玻璃板,适量重物(500-1000g)。注意:检查pH值,用硝酸膜时pH<9。要确保各层间没有气泡,否则会发生局部绝缘,气泡处的DNA 难以吸附到膜上。

9. 于室温转移12-20小时。

10. 取出转移膜,用2×SSC 漂洗数次,以去处困难吸附在膜上的凝胶。

11. 固定:可选择下述方法之一进行DNA固定。

·紫外线固定:使用长波紫外线照射10-20分钟,简单漂洗干燥备用。

·尼龙膜置于120℃烘烤30分钟。

·硝酸纤维素膜置于普通烘箱中80℃烘烤2小时

1.3.3.3 Southern杂交

1. 将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中,贴壁放置(吸附有核酸的一面不要贴壁),赶走杂交膜和管壁间的气泡。

2. 加入20ml Standard buffer,65℃预杂交4-20小时。

3. 将制备的DNA探针沸水浴加热10min,迅速置冰浴5min。全部加入杂交管。

4. 使用和预杂交相同的杂交温度,一般杂交16-20小时。

5. 杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中,储存于-20以备下次使用。这样至少可以保存一年。再次使用之前应在冻融之后,加热至+95℃ 10分钟以变性探针。

6. 取出杂交膜,用Wash Solution I 洗5分钟×3次。

7. 保温冲洗:用 Wash Solution II 于68℃冲洗15分钟×2次。

1.3.3.4 BCIP/NBT 显色检测法

1. 经过杂交及杂交后的冲洗之后,膜置于冲洗液中平衡1分钟。

2. 用干净的平皿,封闭液室温封闭至少60分钟。

3. 用封闭液1:2500—5000稀释 Anti-DIG-AP,例如2μl Anti-DIG-AP加至5-10ml封闭液中(根据染色情况而调整)。稀释液4℃可稳定12小时左右。

4. 加Anti-DIG-AP,37℃反应60分钟。

5. 用冲洗液洗15分钟×3次,每次100ml。

6. 按1:50配制底物显色液:例如100μl“BCIP/NTP储备液”加至5ml显色缓冲液中,未用完的显色剂应避光保存。

7. 显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。

8. 加100ml底物显色液(100 cm2)。将膜及显色剂封在塑料袋中,开始避光显色。显色过程中可以观察。一般数分钟即开始出现颜色,显色过程可以持续至12小时。应绝对避免震动,以免出现颜色带的移位。

9. 当所需要的显色点或带出现之后,蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录;也可以直接保存于TE缓冲液,在此情况下,颜色长期不退。还有一种选择时让膜干燥,颜色消褪。但若将膜放置于TE缓冲液中,显色重新出现。

1.4实验结果及分析:

1.4.1 质粒PCR结果

(P38质粒PCR,最左侧泳道为Marker,右侧为P38 PCR产物)

成功扩增出了特异性的条带

1.4.2 质粒酶切结果

(P38质粒酶切结果,左侧为Marker,右侧只有一条条带,酶切失败)

1.4.3蓝白斑筛选实验结果

蓝白斑筛选后菌落PCR结果

(蓝白斑菌落PCR白斑菌落, 1为Marker,2-5为白斑菌落PCR)

图中2~6均为挑取的白斑进行菌落PCR,其中3,4,6为阳性结果,DNA成功连接,2,5为假阳性结果,DNA未成功连接。

(蓝白斑菌落PCR蓝斑菌落,1为Marker,2-3为蓝斑菌落PCR)

图中2,3泳道均使用的是蓝斑菌落进行PCR,结果发现2号泳道为假阴性,因为其扩增出来的条带分子质量较大。而3号为真阴性,DNA未连接到T-Easy质粒中,质粒中的lac基因表达分解乳糖类似物X-Gal使菌落产生蓝色。而产生假阴性的结果可能是阳性菌落距离阴性菌落过近,与蓝色菌落混合生长。

1.4.4 Southern杂交实验结果分析

(Southern杂交结果)

该图片为其他班的实验结果,但分析可以看出,1号为P38质粒杂交结果,条带清晰。2号为P38使用ECoR I进行酶切的杂交结果,其中酶切结果为各种长度条带,而随机引物探针可以与之结合,所以出现弥散状结果。3号为P38 PCR产物的杂交结果,因为P38 PCR时扩增出了非特异性的条带,所以本次杂交实验出现了两个条带。


2. GFP质粒提取转化及绿色荧光观察实验

2.1实验目的和原理

2.1.1 GFP质粒提取及转化同实验一中P38 质粒的提取及转化

2.1.2阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达

   绿色荧光蛋白(GFP)基因来自海底生物多孔水母,该基因表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光。现已将该基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中,通过阿拉伯糖的诱导,可使该基因在细菌中进行表达。

实验流程图

2.2 实验材料及实验仪器(阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达)

(一)试剂

1、  氨苄青霉素

2、  2% 阿拉伯糖

3、  LB固体培养基(添加amp的终浓度为100μg/ml,添加arabinose为培养基的0.2%)

(二)器材

1.恒温摇床

2.无菌操作台(含酒精灯.)

3.紫外灯

4、  灭菌锅

2.3 实验步骤

2.3.1Arabinose诱导GFP表达

1)        将实验二中提取的质粒pGLO转化到大肠杆菌HB101中(具体步骤参考实验八)。

2)        准备四个LB固体培养平板,其中有两个LB/amp平板,一个LB/amp/arabinose平板和一个LB平板。

3)        将转化菌涂在一个LB/amp和一个LB/amp/arabinose平板上。

4)        将对照菌涂布在一个LB/amp和一个LB平板上。

5)        37℃培养16小时。

6)        紫外灯下进行检测。

2.4实验结果及分析:

在紫外线照射下看到了部分菌落发出淡绿色荧光,说明GFP质粒成功导入细菌内并得到表达

 

3.植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析

3.1 实验目的及实验原理

一、目的

掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。

二、原理

十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中,首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出,然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀,离心后,溶液分为三层,上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液,中层为蛋白质和细胞碎片,下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。

由于CTAB能溶解于乙醇,在洗涤过程中CTAB即可被除去。

3.2 实验材料及实验仪器(植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析)

(一)实验材料

小麦幼苗

(二)试剂

1. DNA 抽提液

用时将下述三种溶液按1:1:0.4 (V/V)比例混匀,加入亚硫酸氢钠(3.8g/L),即为抽提液。

① DNA extraction(500ml):

31.885g    sorbitol (山梨醇)

6.05g    Tris   pH8.2  (一般不调)

② Nuclei lysis buffer(500ml): 

100ml       1M Tris pH7.5

100ml       0.25M EDTA

200ml       5M   NaCl

10g       CTAB

100ml       ddH2O

③ 5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐)  500ml

2.氯仿:异戊醇(24:1)

3 70% 乙醇

4.异丙醇

5.HindIII酶

6.EcoRⅠ酶

(三)器材

1.台式离心机

2.恒温水浴

3.紫外分析仪

4.微量加样器

3.3 实验步骤

3.3.1基因组DNA提取

1.取0.15g左右小麦叶片,在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中,加入700μl抽提液(65℃预热)混匀,加4 ul RNase 室温静置2min。放入65℃水浴中,裂解40-60分钟,期间温和混匀几次。

2.取出裂解好的DNA ,加入700μl 氯仿:异戊醇(24:1),猛烈混匀,离心(10000rpm,10分钟)。

3.取上清于新管中,(不要混入氯仿),加入0.8-1倍预冷异丙醇,缓慢混匀后,再猛烈混匀,使DNA成团,-20℃放置半小时以上。

4.将析出的DNA 离心,14000rpm,10分钟。

5.去掉上清,将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次,挥发除去乙醇,溶于50μl TE或水中。

3.3.2酶切及电泳分析

1. 按照下表加入各成分。

2. 10000rpm离心20 S混匀,37℃反应4h。

3. 0.8%琼脂糖凝胶电泳(样品全部点样)。

3.4实验结果及分析

3.4.1小麦基因组提取电泳检测

(小麦基因组提取结果,100ms,8μL;2,3,4,5为提取小麦基因质粒, 1为Marker)

小麦基因组提取应该是比较容易的实验,但是这次电泳检测并不成功,电泳出现了部分弥散状,电泳过程中基因组DNA全部降解。

 

4. RT-PCR并与基因组DNA PCR对比实验

4.1 实验目的和原理

4.1.1 RNA的提取

掌握RNA提取的基本技术,了解RNA提取过程中的各种注意事项。

RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。

RNA提取和DNA提取有类似的地方,因为它们都是核酸,都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞,然后用提取液将RNA溶出,反复抽提去除蛋白质,加入乙醇沉淀RNA,将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开?DNA和RNA的溶解性不同,DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度,而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度,所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外,RNA的分子量一般比较小,而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体,所以DNA更容易随蛋白沉淀,而RNA具有较好的溶解性。

       RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1%的DEPC水37℃过夜浸泡,然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水,而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应,应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。

       判断RNA 的质量主要有两个标准,一是纯度,二是完整性(是否被降解)。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260/A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明,未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带(如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带)。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳,则用尽量减少电泳时间。

4.1.2 RT-PCR扩增目的基因DNA

学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因,但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子,所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子,不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除,是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶,在反义引物或oligo(d T)的引导下合成mRNA互补的DNA(complemental DNA),再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板,扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5和3端经改造可直接用于基因工程的表达,因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

实验流程图

4.2 实验材料及试验仪器

4.2.1 RNA的提取

(一)材料

暗培养7天的小麦苗,用前光照处理3 h

(二)试剂

  1.Ttizol Reagent

2.氯仿

3.异丙醇

4.70%无水乙醇

5.DEPC处理的ddH2O

6. 氯仿

7. 溴乙啶(EB): 10mg/ml溴乙啶。(注意:该试剂具致癌作用,用时要小心)

8.点样缓冲液Loading buffer(10×):0.25%溴酚蓝,40%甘油。

4.2.2 RT-PCR扩增目的基因DNA

(一)试剂

1. RNA模板

2. cDNA引物

3. 反转录缓冲液

4. dNTP

5. MMLV反转录酶

6. RNA抑制剂(RNasin)

7. Taq酶及10×PCR缓冲溶液

8. 引物(P1、P2)

(二)器材

1.PCR扩增仪

2.电泳仪

3.台式离心机

4.恒温水浴

4.3 实验步骤

4.3.1 小麦RNA的提取

1. 称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末,迅速转移到1.5ml离心管中。

2. 加入1 ml Trizol  Reagent,15~30℃×5min。 

3. 加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15 sec,15~30℃×3min。

4. 冷冻离心12 000 rpm×15min。

5. 将上清液转移到另一个离心管中,加0.5ml预冷异丙醇,混匀,-20℃放置20min。

6. 冷冻离心12 000 rpm×10min,弃上清。

7. 加入0.5ml 70%乙醇于RNA沉淀中并悬浮沉淀,10000 rpm×2min,挥发除去乙醇。

8. 加入30 μl DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。

4.3.2 RT-PCR扩增目的基因DNA

4.3.2.1 RNA的反转录

① 在PCR管中依次加入

RNA模板                 5 μl

Olig(dT)18引物          1μL

DEPC H2O                6 μL

混合后,70℃水浴5 min(破坏二级结构),迅速冰浴5min。

② 在管中依次加入 (反应体系为20 μL):

5×RT buffer                    4μL

RNasin                               1μL

10mM dNTP                 2μL

混匀,37℃保温5min。

M-MΜLV反转录酶             1 μL

置于 42℃水浴,1h。

③ 70℃保温5min(使酶失活)。

④ 于-20℃保存备用。

4.3.2 .2 PCR扩增DNA

在灭菌的0.2ml PCR管中,依次加入

3μl              cDNA

5μl              10×PCR buffer(含Mg2+

1μl              dNTP(10mM each)

2μl              RT引物I

2μl              RT引物II

1μl              Taq DNA聚合酶

加ddH2O 补足50μl ,混匀。

PCR程序:

94 ℃        3 min       

                        95 ℃        30 s

         35 cycles:       57 ℃        60 s

                        72 ℃        90 s               

                    72 ℃        10 min

4.3.2 .3  PCR产物的鉴定

取20μl PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。

4.4实验结果及分析

4.4.1提取RNA电泳检测结果

(RNA提取电泳检测结果, 1为Marker)

图中已经呈现出部分弥散状结果,原因是因为伴随着电泳的过程,RNA在不断地降解,因此会呈现出弥散状。在2、3和4泳道,我们可以明显看出有3条亮带的存在。说明RNA提取质量较高。

4.4.2 RT-PCR电泳检测结果

(RT-PCR电泳结果,1为Marker)

图中2~4号泳道为阳性结果,扩增出特异性的片段。

4.4.3 RT-PCR并与基因组DNA PCR对比

10泳道为Marker,1~9为基因组PCR结果,6、8、9没有克隆出特异条带,其他比较成功,右侧为RT-PCR结果,13号泳道效果不明显,其它效果很好,对比特异性条带可知基因组DNA与cDNA特异性片段并不相同。

总体实验总结

这次实验总共五天,以三条主线四个大的部分进行一系列的分子生物学基础实验。

五天的实验安排的十分紧凑,各个实验之间相互联系,实验中犯了很多错误,当然也学到许多东西,但相比于知识更多的是实验习惯、实验态度和对于实验技术的重新认识。首先是在进行一项实验之前应进行合理的安排,尽量节约时间并且不至于手忙脚乱,两到三个实验交互进行是这五天的主要节奏。另外最大感受是应该培养做好实验记录的好习惯,这样不仅有利于我们最后书写实验报告,还可以帮助我们理解实验,分析实验中出现问题的原因。

另外感谢x老师这几天的辛苦,在实验过程中我们的积极性不高,但老师一直十分尽责,努力帮我们安排好实验,还要催促我们尽量多动手锻炼自己。老师熟练的操作和严谨的态度也给我们留下了十分深刻的印象,见过高水平的技术才明白自己的不足,非常感谢老师孜孜不倦的教导,经过这次实验,我们会更加严格的要求自己,努力提高实验水平,不辜负老师的期望。

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