BLNK，人B细胞连接蛋白（BLNK）酶联检测分析ELISA使用说明书

本试剂仅供研究使用      标本：血清或血浆

樊克生物专业供应：

使用目的：

本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本B细胞连接蛋白（BLNK）含量。

试验原理：

BLNK试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知BLNK浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将BLNK和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中BLNK的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制

自备材料

1．  蒸馏水。

2．  加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3．  振荡器及磁力搅拌器等。

安全性

1．  避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2．  实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

3．  不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

操作注意事项

1．  试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

2．  实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3．  不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

4．  使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5．  使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6．  洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7．  底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

8．  加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

9．  按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法

1、  血清－－－－-操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2、  血浆－－－－-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、  细胞上清液－－-1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、  组织匀浆－－－－-将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液

5、  保存－－－－－－如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备

1．  标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：

2．  洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。

操作步骤

1．  使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．  根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3．  加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4．  甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．  每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．  甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．  每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8．  取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．  在450nm波长处测定各孔的OD值。

建议使用的实验方案

局限

6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。

B细胞连接蛋白（BLNK）ELISA试剂盒性能

1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。

2. 特异性：不与其它细胞因子反应。

3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

结果 判 断 与分析

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的BLNK标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的BLNK含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

3、检测值范围：0-80ng/ml

4、敏感度： 0.1 ng/ml

上海樊克专业生产供应的试剂盒类产品有：双抗夹心ELISA检测、ELISA试剂盒、人ELISA试剂盒、酶联检测试剂盒、国产进口试剂、代测elisa试剂盒、ELISA检测试剂盒、大鼠ELISA试剂盒、小鼠ELISA试剂盒、凋亡相关因子试剂盒、白介素ELISA试剂盒、VIP ELISA kit等实验室产品，产品品质，质量保证。

The performance of kit:

1 sensitivity: minimum detection concentration is less than 1 standard. Linearity of dilution. Sample linear regression and the expected concentration correlation coefficient R value is 0.990.

2: no specific reaction with other cytokines.

3 repeatability: plate, plate between the coefficients of variation were less than 10%.

Human type III procollagen amino terminal peptide ELISA kit steps:

1 before use, all reagents and mixing. Do not allow liquid to produce a large number of bubbles, so as to avoid adding a large number of bubbles, resulting in the addition of the error.

2 according to determine the number of sample number plus standard strip number. Each standard and blank hole is recommended to do the hole. Each sample can be made according to its own quantity, and can be used as a hole in the hole.

3 diluted after standard 50ul in reaction hole, added to the sample 50 UL in reaction hole to be measured. Immediately joined the 50 UL antibody biotin. Cover the membrane plate, gently oscillating mixing, 37 degrees Celsius for 45 minutes.

4 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the washing machine with washing, washing times increased once.

5 per hole adding chain affinity enzyme -HRP 100ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 30 minutes incubation.

6 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the washing machine with washing, washing times increased once.

7 per hole adding substrate A, B 50ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 5 minutes incubation. Avoid light.

8 remove ELISA plate, quickly add 50ul terminated liquid, adding the stop solution immediately after the determination results.

9 od determination of each hole at the wavelength of 450nm.

The result of judgment and analysis:

1, instrument value: Yu Bo 450nm ELISA od read the hole on the instrument

2, to the OD value as a vertical coordinate (y), corresponding ot standard concentrations as a horizontal coordinate (x), do have corresponding curve, sample ot content can be according to the OD value by standard curve conversion out corresponding concentration, multiplied by the dilution multiple; or with the standard concentration and the OD value calculated the regression equation of the standard curve, the sample OD value in the equation to calculate the sample concentration, multiplied by the dilution factor is the actual concentration of the sample.

3, detection range: 0-100ng/ml

4, sensitivity: 0.39ng/ml

 

第二篇：胎球蛋白A检测试剂盒(ELISA酶联免疫法)简介说明书

人胎球蛋白A检测试剂盒（酶联免疫法）

（德国DRG EIA4522）

预期用途

此试剂盒可用于血清，血浆，细胞上清，组织提取物和尿液中人胎球蛋白A也称之为α-2-HS糖蛋白的定量的检测；血清或血浆中胎球蛋白A的检测可作为某些癌症及基因遗传缺陷的血清蛋白诊断的辅助工具；此试剂盒仅供实验室专业人士使用

简介

胎球蛋白A也称之为α-2-HS糖蛋白，是由两个氨基末端抑制域和一个较小的羧基末端域组成的59 kDa 分子量的糖蛋白；由肝脏合成，分泌至血流，成年哺乳动物体内的浓度范围在0.5-1.0g/L；婴儿期的血清胎球蛋白A含量高，参与蛋白酶抑制活性，与钙代谢和骨生成调节相关；累积于骨和牙齿内，作为生物学上非胶原骨蛋白的主要部分，研究表明，胎球蛋白A是循环中主要的钙化抑制剂；干涉钙盐沉淀；近期研究显示低水平胎球蛋白A的慢性肾脏衰竭患者与心血管病的高死亡率显著相关；另一方面，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，这是独立于胰岛素抑制剂的其他标记物；另外，高胎球蛋白A水平还可作为心血管疾病的的危险标记物

实验原理

此试剂盒可用于血清样本中人胎球蛋白A的定量检测；采用双位点夹心法，羊抗人胎球蛋白A多抗结合人胎球蛋白A的不同位点

将含人胎球蛋白A的试验标准品，质控品和预稀释样本加至包被了高度亲和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔内，第一次孵育，包被抗体捕获样本中的人胎球蛋白A，未结合的蛋白洗板除去，然后加入HRP标记的抗人胎球蛋白A酶联物加入至每孔，“夹心-人胎球蛋白A-HRP-标记的酶联物”形成夹心，未结合的示踪抗体通过洗板除去，结合于包被板上的HRP酶免物与底物液定时反应，然后在酶标仪上检测；结合于包被胎球蛋白A上示踪抗体酶活性与样本中胎球蛋白A的含量直接相关，在点对点或三次回归模式下以标准品的浓度比上OD值绘制标准曲线，样本中的胎球蛋白A可直接从标准曲线上得到

试剂：准备与贮存

此试剂盒收到后立即贮存于2-8℃下，效期见试剂盒标签；所有成分在2-8℃下可保存至有效期

使用前，所有试剂平衡至室温，不同批次的试剂不能交换使用

1. 包被板，96孔，包被了抗人胎球蛋白A抗体；微孔板固定于板架上，密封于含有干燥剂的铝箔密封袋内；贮存于2-8℃至有效期

2. 胎球蛋白A示踪抗体，1瓶，0.6 ml，浓缩，HRP标记的抗人胎球蛋白A示踪抗体溶于稳定的蛋白基质中；此试剂使用前需用示踪剂抗体稀释液进行稀释；贮存于2-8℃至有效期

3. 示踪抗体稀释液，1瓶，11ml，即用，Trizma盐酸溶于缓冲液；根据实验步骤用于示踪抗体稀释；贮存于2-8℃至有效期

4. 试验缓冲液，浓缩，1瓶，11ml，含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐；建议使用前以1:10比例用双蒸水稀释（如11 ml浓缩+99 ml的双蒸水）；贮存于2-8℃至有效期

5. 洗涤液，浓缩，1瓶，20ml，30倍浓缩；试验前需用580ml的双蒸水稀释，混匀；一旦稀释，不含叠氮化物防腐剂的磷酸缓冲盐洗涤液会含表面活性剂；稀释的洗涤液在室温下可保存至效期

6. HRP底物液；1瓶，12ml，含过氧化氢的TMB底物液；贮存于2-8℃至有效期

7. 终止液，1瓶，12ml，0.5M硫酸，贮存于2-8℃至有效期

8. 胎球蛋白A标准品，5瓶，含胎球蛋白A，不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质；各标准品浓度见瓶子标签；3次冻存周期使用后，所有标准品保存至-20℃或更低

9. 胎球蛋白A质控，2瓶，含人胎球蛋白A，不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质，各质控的精确浓度范围见瓶子标签，3次冻存周期使用后质控保存至-20℃或更低

安全注意事项

1. 此试剂用于临床参考实验室，仅供医生或实验室专业人士体外诊断用

2. 若试剂是有潜在感染风险的，试验操作和处理时应戴手套

3. 避免接触含TMB，过氧化氢，硫酸的试剂，TM,B会刺激皮肤和粘膜，导致皮肤过敏反应；TMB还可能是致癌物质；皮肤接触到硫酸会导致严重灼伤，不要接触到眼睛，皮肤，衣服，不要吸入烟雾，一旦接触，应立即用大量水冲洗至少15min

4. 良好实验室操作规范

实验所需材料但试剂盒未提供

1. 精确的单通道移液器，10-25-100-1000ul

2. 适于100 ul的可重复用分液器

3. 适于所有体积的一次性枪头

4. 一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm

5. 带盖的一次性塑料瓶；100-1000ml

6. 铝箔纸

7. 双蒸水或去离子水

8. 塑料盖板或聚乙烯薄膜

9. 多通道洗涤瓶或全自动（半自动）洗板系统

10. 酶标仪，450nm

样本采集

人胎球蛋白A的检测所需血清或血浆样本量仅10 ul

个人在采样前无需特殊准备，全血采集，室温下立即凝集30min，然后离心分离出血清（850-1500 xg 10min）。全血采集3小时内需将血清从凝集中分离出来，转移至另一干净试管；血清样本可保存在-20℃或更低，避免超过三次的冻融

建议采用24小时尿液来检测尿液中的胎球蛋白A；采集第二天早晨的尿液，排除采样前刚进行剧烈运动的，因肾功能不全导致多尿的；由利尿药引起的人体内尿蛋白含量波动降低，可能与尿肌酸酐浓度相关；

细胞上清，组织提取物则需进行试验样本的倍比稀释；多个平行样检测得到更精确的试验结果

实验步骤

患者样本的准备

患者血清或血浆样本在检测前需用试验缓冲液进行1:10000 的稀释

1. 以1A和1B 标记两个试管（12x75 mm）

2. 加1ml的试验缓冲液至各试管（1A和1B）

3. 加10 ul的患者血清至1A试管，混合（1:100）

4. 从1A管内吸取10ul已稀释的样本至1B试管，混合（1:10000）

注意：建议采用精确/经校准的移液器，稀释过程小心操作，得到更精确的结果；建议采用多通道（Combitip）12.5ml的Eppendorf 可重复移液器加1ml的试验缓冲液，而不用50ml的枪头

患者尿液样本的实验前用试验缓冲液1:100的稀释

1. 以1标记一试管（12x75 mm）

2. 各管加1ml试验缓冲液

3. 加10ul患者尿液样本至1管，混合（1:100）

注意：若所得结果中样本浓度高于5个标准品中的最高标准品浓度，则尿液样本需进一步稀释（如1:500），然后重新检测

试剂准备

1. 试验前将所有试剂平衡至室温，不同批次的试剂不能混合使用

2. 使用前，试验缓冲液（浓缩）及洗涤液（浓缩）需进行稀释，配制成工作液；详情请见“试剂”部分

试验操作

1. 将实验所需板条固定于板架上，标准品，质控品及未知样本做双孔检测

2.

3. 1:100的稀释

4. 每孔加100 ul的试验缓冲液

5. 混匀，盖板，避免暴露于阳光下

6. 室温下孵育2小时

7. 示踪抗体工作液的准备，示踪抗体1:21的用示踪抗体稀释液稀释；每条板需1ml的示踪抗体稀释液+50 ul的胎球蛋白A示踪抗体

8. 移去盖板，弃去孔内反应液，每孔加350ul的洗涤工作液洗板5次，然后彻底吸出孔内液体，或可采用全自动洗板机

9. 以上稀释的示踪抗体工作液加100 ul至各孔

10. 盖板，避免暴露于阳光下

11. 室温下孵育30min

12. 移去盖板，弃去孔内反应液，每孔加350ul的洗涤工作液洗板5次，然后彻底吸出孔内液体，或可采用全自动洗板机

13. 每孔加100 ul的ELISA HRP 底物液

14. 盖板，避免暴露于阳光下

15. 室温下孵育20min

16. 移去盖板，每孔加100 ul的终止液，混匀

17. 10min 内在450nm酶标仪上检测吸收值

注意：为降低背景色，可以双波长检测，设置参考波长：595nm 或620 nm 或630nm

操作注意事项

1. 建议所有标准品，质控品和未知样本做双孔检测；各双孔检测的吸收均值用于数据处理，结果计算

2. 将光敏试剂保持装于原琥珀色瓶内

3. 将剩余的包被板条放存在含干燥剂的密封袋内，避免受潮

4. 操作严格，移液器经校准可确保试验的可重复性

5. 孵育时间或温度也可能会影响试验结果

6. 避免微孔内产生气泡，可能会导致结合率低，双孔读数变异系数高

7. 使用前所有试剂都应彻底混匀，避免产生气泡

结果说明

1. 计算各双孔吸收值均值

2. 所有的吸收均值都减去标准品1（即 0ng/ml）的吸收均值

3. 在点对点或对数-对数坐标纸上以标准品的浓度为X轴，吸收均值为Y轴绘制标准曲线；或是采用数据处理软件进行结果计算

质控品和样本浓度（1:10000）可直接从标准曲线上读取，若采用的是对数-对数或数据处理软件计算则需用到对数转换；样本校正吸收值在浓度1ng/ml 和下一个最高标准品间的需通过公式计算：

未知样本浓度 = 未知样本吸收值

2 标准品吸光值 nd x 2nd 标准品浓度值

典型标准曲线

以下为典型示例的吸收值及标准曲线；此标准曲线不能用于其他实验的计算

期望值

70例正常成人血清检测人胎球蛋白A ，95%百分比的正常值范围在0.35-0.95 g/L，均值为0.57 g/L ;标准偏差为0.13 g/L

10000倍的稀释因子应考虑到样本浓度的最终计算

如：从标准曲线上直接得到的10000倍稀释样本值是24.3 ng/mL,那原样本浓度为

24.3 ng/mL x 10,000 = 243000 ng/mL = 0.243 g/L

操作局限性

1. 人胎球蛋白A直接检测的最低浓度为5.0 ng/ml（试验分析灵敏度），10000倍稀释的样本血清回算后，原血清样本浓度的最低检测限是50 ug/ml

2. 因人胎球蛋白A检测无金标准，所以试验标准通过稀释含蛋白基质的高度纯化重组人胎球蛋白A建立

3. 可直接读取的未知样本浓度高于350 ng/ml，建议对样本进一步稀释

4. 若实验室酶标仪在450nm处的OD值不能超过2.0，建议将标准品6 舍去，不做检测 5. 细菌或真菌污染的样本或试剂，或试剂间的交叉污染都可能会导致错误结果 6. 聚酯树脂处理的去离子水不能激活过氧化氢酶

质量控制

适当的已知胎球蛋白A水平的质控可确保试验结果的有效性；建议所有实验室除了试剂盒本身的质控外，还应额外建立自己实验室的胎球蛋白A质控

性能指标 1. 灵敏度

人胎球蛋白A分析灵敏度，零标准品20次重复试验，95%置信区间，最后得5.0 ng/ml

2. 线性

两个人的血清样本进行稀释检测，结果如下，ng/ml

3. 精密度

两个样本在一个试验中做20次重复检测，分析板内差异

4. 回收率

本译文仅供参考，请以原说明书为准 深圳科润达生物工程有限公司

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