论文创新点：

1、首次把根-土界面的研究和兽药污染联系起来，过去相关的一些研究主要是针对重金属方面的，分析根-土界面一些特有的性质对磺胺类药物毒性效应的影响

2、研究手段，由先前的重视“静态端点”研究转向对把握动态过程的研究，这是研究解决环境污染和生态破坏及其所造成的危害和结果手段的一大进步。

磺胺间甲氧嘧啶在玉米根-土界面毒性研究

摘要：通过根际袋土培试验，研究了磺胺间甲氧嘧啶(SMM)对玉米根际与非根际土壤酶活性和土壤呼吸强度的影响。结果表明，无论是否有根系作用，过氧化氢酶对磺胺间甲氧嘧啶胁迫的反应均不敏感。但在高浓度磺胺间甲氧嘧啶(50 mg·kg^{- 1})作用下，试验初期对脲酶有明显的抑制作用，而在试验后期则表现出一定的促进作用，且在SMM胁迫下根际效应表现的更为明显的。SMM胁迫下对根际与非根际土壤呼吸均有抑制作用，随浓度的浓度增大，抑制作用越明显，且由于玉米根际作用，一定程度上缓解了SMM污染对根际微生物的毒害。一般情况下，根际土壤脲酶和过氧化氢酶活性及土壤呼吸强度均要大于非根际土壤，根际效应明显。

关键词:磺胺间甲氧嘧啶；脲酶；过氧化氢酶；土壤呼吸；玉米；根际效应

中图分类号：       文献标识码：A

The Eco-toxicological Effect of Sulfadiazine Sodium on Corn Rhizospheric and Non-rhizospheric Soil

Abstract：The effects of sulfadiazine sodium on soil respiration and activities of urease and catalase in corn rhizospheric and non-rhizospheric soil were investigated by using a rhizobx simulating rhizosphere environment. The study showed that sulfadiazine sodium had not significantly changed the catalase activity during the most incubation periods whether lt effected by corn rhizospheric or not. The activity of soil urease was inhibited at the beginning but stimulated afterwards in high dosage concentration of sulfadiazine sodium(50 mg·kg^{- 1}). The rhizosphere soil urease activities of SMM polluted corn lands are higher than those of CK lands, and have a significant rhizosphere effects. Soil respiration was inhibited by sulfadiazine sodium in different degrees in corn rhizospheric and non-rhizospheric soil , the degress of the inhibition had the dose-effect relationship with the concentration of sulfadiazine sodium, the higher of treated concentration of sulfadiazine sodium, the stronger inhibition of soil respiration suffered. SMM was less poisonous to soil respiration with the effect of corn rhizospheric .Meantime, the enzyme activities and soil respiration in rhizospheric soil were higher than that of non-rhizosphere all along , the rhizosphere effect was significant.

Keywords: sulfadiazine sodium; urease; catalase; soil respiration; corn; Rhizosphere effect

抗生素被大量的用到畜牧业生产中，而其在畜禽生产中的使用则令人担忧，目前大量抗生素常以高剂量使用治疗各种疾病，以低剂量使用促进畜禽生长和增产。据调查，在美国每年70%抗生素用作畜禽生长促进剂^[1]，而在丹麦1997年也有一半以上的抗生素用作畜禽的生长促进剂^[2]。然而抗生素通过口服或肌肉注射进入动物体内并不能被完全吸收, 大部分随尿粪等排出体外。研究结果表明, 以母体或代谢物的形式随尿或粪便排出体外的量约占抗生素用药量的40 ~90%^{[3-6 ]}。 这些药物随动物粪便作为肥料施用于农田，对农田生态系统造成污染，影响土壤微生物和农田良性循环，并在环境中产生大量耐药致病菌，最终将影响人类的健康^{[7-8 ]}。近年来，抗生素对生态环境的影响日益引起人们的关注。

  　磺胺类药物是一类传统的人工合成抗菌药，是以磺酰胺(磺胺)为代表的各种衍生物的总称，具有对氨基苯磺酰胺结构。由于抗菌谱广价格低廉，因此这类药物是兽药临床和畜牧业养殖最常用的药物添加剂之一。有研究表明，磺胺类药物在土壤中的吸附性比较弱^{[9-12 ]}，即具有较强的移动性，容易迁移至地表和地下水对水质产生污染。此外，磺胺类药物在土壤中不易降解^[13]，所以能够在土壤中长期累积，从而对土壤生态系统健康造成威胁。

   土壤酶主要来源于土壤微生物的生命活动，且易受环境中物理、化学和生物等条件的影响，环境污染条件下土壤酶活性变化很大，因此土壤酶一定程度上可以反映出土壤的环境状况。土壤微生物的呼吸强度可以反映土壤微生物的总活性，是评价化学物质对生态环境安全性的重要指标^[14-15]。植物根际是根与土壤环境相互耦合的生态与环境界面，是微生物代谢活动特别旺盛的场所, 能加快土壤中有机化合物的分解及其它矿质元素的活化^[16]，由于经常不断地接受根系脱落物和分泌物，其理化性质和生物学特性与非根际土壤有很大的差异。因此，有关污染物在根－土界面的形态及毒性变化的研究一直是环境科学研究的热点，但目前相关的研究主要集中于重金属及有机污染物方面^[17-20]，而有关兽药在根-土界面和非根-土界面毒性效应的研究开展的较少，因此急需开展相关方面的研究。本文研究了磺胺间甲氧嘧啶作用下，玉米根－土界面与非根－土界面土壤脲酶和过氧化氢酶活性及土壤呼吸强度变化，掌握在土壤中磺胺间甲氧嘧啶作用下，作物是否产生明显的根际效应及根际效应对土壤特定生化指标的影响, 从而掌握磺胺类药物在根-土界面微域环境中的生态环境行为，以期为制定降低磺胺类兽药对环境的危害的措施提供科学依据。

1  材料与方法

1. 1　供试材料

（1）供试药品: 磺胺嘧啶钠( Sulfadiazine Sodium) :分子式为C10H9N4NaO2 S，化学名为N—22嘧啶基—42氨基苯磺酰胺钠盐。规格为1mL: 100mg (江西新世纪民星动物保健品有限公司)

（2）供试土壤和种子:供试土壤采自河南师范大学生物园，属于未受任何化学品污染的洁净土壤，取自0-20cm耕作层，其理化性质见表1。试验时将土风干、过2mm筛。玉米，品种为天塔5号，F1代,发芽率98%；购自新乡市种子公司。

表1 供试土壤理化性质

Table 1 The physical-chemical properties of test soil

1）阳离子交换量;2）:总磷;3）:总钾;4）:凯氏氮

1.2 实验设计

   盆栽实验，通过根际袋区分根际土壤与非根际土壤（实验装置见图1）。取新鲜土壤自然风干，过 2 mm筛。磺胺间甲氧嘧啶溶解于水后，均匀加入到上述土样中，充分搅拌、混匀，待用。磺胺间甲氧嘧啶浓度设为0， 5 mg·kg^{- 1}，20 mg·kg^{- 1}，50 mg·kg^{- 1} 4个处理， 3次重复。分别称取上述土样1kg于花盆中，其中 250g装在 300目的尼龙网袋中，作为根际土壤。种子播于根际袋中，待发芽后每盆定植 5株幼苗（图1）。培养期间保持土壤含水量在田间最大持水量的60%。分别于种子发芽的第5、10、15、20、25和 30 d，取玉米根－土界面与非根－土界面不同处理的土样，测定土壤脲酶和过氧化氢酶活性及土壤呼吸的强度。

图1　根际袋

Fig. 1  Rhizobag.

1.3 土壤呼吸强度的测定

本实验采用直接吸收法（密闭法）滴定测定土壤呼吸强度。试验处理：称取相当于干重为50g土样于100 mL高型烧杯中，加入少量水湿润土壤，使土壤含水量达田间最大持水量的50%。将小烧杯放入容积为1000 mL的可密闭标本瓶中，同时放入盛有20 mL 0.2 mol·L ^{- 1}标准NaOH的小烧杯，封闭瓶口后置于25±1℃的生化培养箱中黑暗培养1天，取出小烧杯测定土壤呼吸作用，重复3次，同时做空白对照。土壤CO₂ 的释放量呼吸强度以100g干土24h CO₂释放量^[21-22]表示，单位mg/100g.24h。

1.4 土壤酶活性的测定

参照关松荫的方法^[23]，靛酚蓝比色法测定脲酶活性，单位以100 g土1 h 催化尿素降解产生NH₄⁺-N的毫克数表示(37℃)；高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性，单位以1 g土1 h 消耗的0.1 mol·L ^{- 1} KMnO₄毫升数来表示(室温, 20℃)。

1.5数据分析与统计

本文中数据的平均值、所作的方差分析、t检验均采用SPSS统计软件分析获得。

2 结果与分析

2.1 磺胺间甲氧嘧啶对玉米根际与非根际脲酶活性的影响

脲酶是一种重要的土壤酶，与土壤生物地球化学循环中的氮循环密切相关。土壤脲酶能促进土壤尿素分子中酰胺碳氮键的水解，生成的氨是植物氮素营养来源之一，在氮肥利用和土壤氮素代谢方面有重要的意义^[24-25]。不同处理土壤中脲酶活性的动态变化见图2和图3。研究表明，在整个试验周期内，玉米根际与非根际脲酶活性变化较大，其抑制率在-36.2%-45.1%之间，且均在试验第25d脲酶活性达到最大。在试验第5d，低浓度SMM（5 mg·kg ^{- 1}）作用下玉米根际与非根际脲酶活性与对照相比，表现出激活效应，这与大多数的研究结果相一致。当土壤中SMM浓度为20 mg·kg ^{- 1}和50mg·kg ^{- 1}时，SMM对玉米根际与非根际脲酶活性有明显的抑制作用，且随着土壤中SMM浓度的增加，对脲酶活性的抑制作用增强，即w_(SMM) = 20mg·kg^{- 1}时，玉米根际与非根际脲酶活性的抑制率分别为13.0%、24.9%，w_(SMM) = 50 mg·kg ^{- 1}，抑制率分别为42.2%、42.9%。在试验的第10-25d，当 SMM的浓度为20 mg·kg ^{- 1}时，玉米根际与非根际脲酶的活性与对照相比均处于激活状态，而当SMM的浓度为50 mg·kg ^{- 1}时，脲酶活性的激活效应则能持续到整个试验周期。本实验的研究结果与国外相关报道一致^[26]。

由图2和图3可见，不同试验时期玉米根际与非根际脲酶活性的动态变化，研究表明，在SMM浓度为5 mg·kg ^{- 1}的作用下，玉米根际与非根际脲酶活性与对照呈现相同的变化趋势，且差异并不显著 （P ＞ 0. 05)。对于玉米根际土壤，SMM污染胁迫下的脲酶活性表现出更为明显的根际效应，根际内脲酶活性较没有污染和非根际脲酶活性都大大增加，尤其在试验10-25d，w(SMM) = 50 mg·kg ^{– 1} 时，分别为同时期对照根际土壤的1.2-1.4倍。高浓度SMM（50 mg·kg ^{- 1}）胁迫下，在试验前15d，根际土壤中脲酶活性提高了137.4%, 而同等处理水平下的非根际土壤中其活性提高了123.8%; 在对照根际和非根际土中则仅上升了16.3%和11.8%。以上结果表明，根际土壤中脲酶活性的激活效应强于非根际土壤，根际效应明显。

   

图2 磺胺间甲氧嘧啶对玉米根际脲酶活性的影响

Figure 2 Influence of Sulfadiazine Sodium on the activities of urease in corn rhizosphere soil

图3 磺胺间甲氧嘧啶对玉米非根际脲酶活性的影响

Figure 3  Influence of Sulfadiazine Sodium on the activities of urease in corn non-rhizosphere soil

2.2磺胺间甲氧嘧啶对玉米根际与非根际过氧化氢酶活性的影响

   　过氧化氢酶广泛存在于土壤和生物体内，能有效地防止土壤及生物体在新陈代谢过程中产生的过氧化氢对生物体的毒害，其活性与土壤的呼吸强度和微生物的活性有关。因而，一直是人们衡量外来物质对土壤微生物活性影响的一个重要研究指标^[27-29]。由图4和图5可见，在试验的第5d，玉米根际与非根际内过氧化氢酶水平变化不明显，表现出微弱的激活效应。在试验的第10-30d，在浓度为20 mg·kg ^{- 1}和50 mg·kg ^{- 1}的SMM作用下，玉米根际与非根际过氧化氢酶的活性于对照相比变化较小，差异不显著， SMM对土壤过氧化氢酶活性无显著影响。

SMM胁迫下，玉米根际与非根际土壤中过氧化氢酶活性分别在第10d、15d时达到最大，随后均逐渐减小。在试验的第25-30d，根际与非根际内过氧化氢酶活性差异已达到显著水平(P < 0. 05)，且从数据的对比可知，根际土壤过氧化氢酶活性要比同期的非根际土壤过氧化氢酶活性要高，根际效应明显。

图4 磺胺间甲氧嘧啶对玉米根际过氧化氢酶活性的影响

Figure 4  Influence of Sulfadiazine Sodium on the activities of CAT in corn rhizosphere soil

图5 磺胺间甲氧嘧啶对玉米非根际过氧化氢酶活性的影响

Figure 5  Influence of Sulfadiazine Sodium on the activities of CAT in corn non-rhizosphere soil

2.3磺胺间甲氧嘧啶对玉米根际与非根际土壤呼吸作用的影响

SMM污染下玉米根际与非根际土壤呼吸强度的动态变化见图6和图7。 研究表明，在玉米非根际，5d后，土壤呼吸强度差异不大。15d后, 中浓度(20 mg·kg ^{- 1})和高浓度(50 mg·kg ^{- 1}) SMM作用下，土壤呼吸强度表现出明显的抑制作用，且抑制率与浓度正相关, 抑制率分别为62.3%、84.7%。20 d后抑制效应依然很显著, 抑制率分别为45%、47.5%。中浓度(20 mg·kg ^{- 1})处理下，土壤土壤呼吸强度恢复较快，25 d基本恢复到对照水平, 但高浓度处理(50 mg·kg ^{- 1})下，土壤土壤呼吸强度恢复较慢，30 d 时其活性水平仍低于对照。

由图6和图7所示，玉米不同时期土壤呼吸强度的动态变化，不同浓度SMM作用下，玉米根际与非根际土壤呼吸强度随时间的变化为先降低后逐渐恢复。其中在玉米非根际，在浓度为5mg·kg^{- 1}的SMM作用下，10d时抑制率为71.6%，15d时抑制率为11.8%，25d后基本恢复到对照水平。

由图6和图7可见，在试验第15-20d，低浓度SMM（5 mg·kg ^{- 1}）作用下，玉米根际土壤呼吸强度高于对照，土壤呼吸强度分别为对照根际土壤呼吸强度的1.1、1.3倍，而在非根际则无此现象。但在中浓度(20 mg·kg ^{- 1})和高浓度(50 mg·kg ^{- 1})作用下，根际土壤呼吸强度明显要低于对照组的根际土壤呼吸强度，分别为同期对照组根际土壤呼吸强度的47.5%和85.3%，19.1%和73.5%。通过本实验可以看出，无论是否存在根际效应，当w(SMM) ＞ 20mg·kg ^{– 1} ，SMM对土壤呼吸强度有明显抑制作用。当土壤中SMM浓度为 20 mg·kg ^{- 1}和50mg·kg ^{- 1}时，根际土壤呼吸强度没有非根际土壤呼吸强度有较大程度的下降，其中在第10d时，根际内土壤呼吸强度的抑制率为5%、23.4%，非根际内则分别为26.1%、89.5%。

图6 磺胺间甲氧嘧啶对玉米根际土壤呼吸强度的影响

Figure 6  influence of Sulfadiazine Sodium on the activities of respiration in corn non-rhizosphere soil

 

图7  磺胺间甲氧嘧啶对玉米非根际土壤呼吸强度的影响

Figure 7  influence of Sulfadiazine Sodium on the activities of respiration in corn rhizosphere soil

3  讨论

3.1　磺胺间甲氧嘧啶对脲酶、过氧化氢酶及土壤呼吸强度的影响

SMM对脲酶活性的影响多表现为激活效应，且高浓度作用下，对脲酶活性有较长时间的激活效应。脲酶受到激活机理，一方面可能是由于土壤中有机质对SMM的吸附作用，或者是添加的SMM被土壤微生物分解后的产物可以作为酶促反应的底物，另一方面可能是污染污直接作用于酶分子本身，改变了酶的构象，使酶的活性中心受到激活所致。在低浓度SMM（5 mg·kg ^{- 1}）作用下，与对照脲酶活性呈现出相同的变化趋势，且二者之间差异并不显著 （P ＞ 0. 05)，其原因可能与低浓度SMM的降解速率有关。研究表明浓度越低降解速率越快，半衰期越短^[30]，原因可能是，SMM是抗菌药物，对微生物活性有抑制作用，在一定量的土壤中其微生物数量基本恒定，在药物浓度较低时，土壤微生物比较活跃，药物会被快速降解；而随药物浓度增加，同样数量的微生物对药物的降解能力会被削弱，因此，SMM的毒性效应则能够持续更长的时间。

另外，本研究表明SMM对土壤过氧化氢酶的作用都不显著, 抑制率一般在-6%~4%，说明在试验浓度范围内，过氧化氢酶对SMM不是很敏感。通过比较SMM对脲酶和过氧化氢酶产生的影响可以看出：脲酶对SMM表现出较好的适应性，在较短的时间内，即可从很强的抑制作用转变为激活作用，而过氧化氢酶对SMM不敏感, 受到影响较小。两种酶抑制率或激活率均呈现一定的波动性，主要是因为SMM本身可以作为一种碳源或氮源被微生物利用分解，所以经过一段适应期后酶通常会被激活，但由于新的抑制产物的生成又会使酶再次受到抑制。

SMM对土壤呼吸强度有抑制作用，且随着浓度的增大，抑制作用越明显。高浓度处理下，土壤呼吸强度恢复较慢，这可能与SMM在不同浓度下降解速率不同有关。土壤呼吸强度随时间的增长逐渐恢复，可能原因是，在实验前期由于SMM的胁迫及其有害代谢产物的不断积累，使得土壤微生物呼吸强度降低，而随着SMM的不断降解、吸附、土壤微生物耐受性的增加，呼吸强度逐渐恢复。

3.2 磺胺间甲氧嘧啶胁迫下的根际效应

根际环境有别与非根际，根际内脲酶和过氧化氢酶活性及土壤呼吸强度均强于非根际，一方面可能是因为根系本身分泌酶类和各种营养物质，且土壤酶活性与微生物是分不开的，根系直接影响的土壤范围是微生物特殊的生境，根系内微生物的数量比根系外要高，环境受到刺激时，也使微生物分泌酶量增加，而这些游离酶又会很快被固定在土壤有机无机颗粒上，并稳定地表现出酶活性。无论是否有根系作用，过氧化氢酶对磺胺间甲氧嘧啶胁迫的反应均不敏感，但在SMM污染胁迫下，脲酶活性表现出更为明显的根际效应，可能是因为SMM进入根际环境中能促进某些植物根际微生物的活性，从而分泌脲酶的能力得到提高。SMM胁迫下的根际土壤呼吸强度明显要低于对照组的根际土壤呼吸强度，但根际内土壤呼吸强度受抑制程度弱于非根际土壤，说明在玉米根际，由于根际作用，降低了SMM对的毒性，同时在一定程度上缓解了SMM污染对根际微生物的毒害。

4  结论

4.1 一般情况下，玉米根际内脲酶和过氧化氢酶活性及土壤呼吸强度均大于非根际，说明玉米根系对其起刺激作用。

4.2 高浓度SMM在试验初期对脲酶有强的抑制作用，实验后期一直处于激活状态，且在SMM胁迫下的脲酶活性表现更为明显的根际效应。

4.3 当w (SMM) <50 mg·kg ^{– 1} 时，无论是否有根系的存在，过氧化氢酶对SMM胁迫的反应不敏感。

4.4 SMM胁迫下对根际与非根际内土壤呼吸强度有抑制作用，且浓度的增大，抑制作用越明显。

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