目 录
预习报告示范................................................................................................................... 2
实验 还原糖和总糖的测定 ............................................................................................... 2
实验二:(Fehling试剂)直接(热)滴定定糖法 ............................................................... 2
实验报告示范................................................................................................................. 15
实验 还原糖和总糖的测定 ............................................................................................. 15
实验二:(Fehling试剂)直接(热)滴定定糖法 ............................................................. 15
一、实验原理................................................................................................... 15
二、实验用品................................................................................................... 15
三、实验操作步骤............................................................................................ 16
四、实验记录及计算结果 ................................................................................. 17
五、结果与讨论 ............................................................................................... 17 1
生物化学实验基本操作
一、实验目的
1、熟悉化学类实验室的基本常识、规则、安全及防护知识。
2、掌握基本实验操作及常用仪器的使用方法。
3、通过实际操作,进一步掌握理论知识,能独立完成真个实验的设计、操作及计算。
二、实验仪器与试剂
1、实验器材
2、实验试剂
三、实验内容
(一)蛋白质的定量测定
1、实验原理
Bicinchoninic acid (BCA)法是近来广为应用的蛋白质测定方法。即在碱性环境下,蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562nm处有高的光吸收值,并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。
2、实验方法
(1)、工作溶液(Working Reagent,WR)的配制:
将50体积BCA Reagent 与1体积Cu Reagent 混合即为WR工作试剂,呈嫩绿色。
(2)、标准蛋白溶液配制:
用双蒸水与待测蛋白样品匹配之缓冲液进行倍比稀释:40μl 4000μg/ml BSA+60μl 稀释溶液(H2O)=100μl(BSA=1600μg/ml),从中取出50μl连续倍比稀释,得到BSA标准溶液1600、800、400、200、100、50、25μg/ml,各50μl。
(3)、蛋白测定
蛋白质浓度线性检测范围为10-2000μg/ml。微板测定用96孔板,反应终体积225μl,用酶标仪测定。
a. 微板测定:用加样器将25μl标准品与200μl WR工作液混合于微板孔中。
b. 37℃恒温反应30min。
c. 将反应管温度冷却至室温,测定562nm(实际测定波长为570nm)光密度(OD)值。
d. 绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(μg/ml),轴为各标准管对应的OD值。绘制excel拟合曲线。
3、实验结果
(1)、微板测定方案实验数据
(2)、根据两次测得的吸光度值分别绘制拟合曲线,分别为蛋白浓度 –吸光度(1)和蛋白浓度 –吸光度(2)。
4、结果讨论
(二)PBS缓冲液的配制
1、0.2M Na2HPO4 :称取7.16g Na2HPO4-12H2O,溶于100ml水。
0.2M NaH2PO4 :称取3.12g NaH2PO4-H2O,溶于100ml水。
2、各种浓度PB(pH=7.4):
先配0.2M PB(pH=7.4,100ml):取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4,81ml 0.2mol/L的Na2HPO4,测得溶液pH低于7.4,滴NaOH至pH计测得pH=7.4即可。
然后,只需将0.2M PB(pH=7.4)按相应比例适当稀释即可,如:
0.1M PB(pH=7.4):取50ml 0.2M PB,加水稀释至100ml即可。
0.01M PB(pH=7.4):取5ml 0.2M PB,加水稀释至100ml即可。
0.02M PB(pH=7.4):取10ml 0.2M PB,加水稀释至100ml即可。
3、加入NaCl至0.9%(g/100ml)即可。
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