薄层色谱

薄层层析—APC药片的剖析

【实验目的】:

1、学习薄层色谱分离的原理

2、掌握薄层色谱分离的操作方法。

3、掌握薄层板制备,点样,展开等操作。

【实验原理】:

色谱法是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配)的不同,让混合物的溶液流经该物质,经过反复的吸附和分配等作用,从而将各组分分开。其中流动的体系叫做流动相。流动相可以是气体,也可以使液体。固定不动的物质成为固定相,固定相可以是固体吸附剂,也可以是液体(吸附在支持剂上)。根据组分在固定相中的作用原理不同,可以分为吸附色谱、分配色谱、

离子交换色谱、排阻色谱等。按操作条件可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气象色谱和高压液相色谱等。流动相的极性小于固定相极性时为正相色谱,而流动相的极性大于固定相的极性时为反相色谱。

薄层色谱常用TLC表示,又称薄层层析,属于固-液吸附色谱。它是将吸附剂(如氧化铝、硅胶等)或支持剂(如纤维素粉、硅藻土等)均匀地涂布在一块玻片上,形成一薄层,把要层析的样品点到薄板上,再用适当的溶剂展开而达到分离和鉴别的方法。

根据原理不同,薄层层析可分为吸附层析和分配层析两类。分配层析是由于样品在支持剂上通过两种溶剂间的反复分配作用而得到分离和鉴别。吸附层析是利用吸附剂对样品所含的不同物质吸附能力不同以及展开剂对被吸附的不同物质溶解力不同,在层析过程中,随着展开剂的展开,薄层上就连续不断地发生溶解、吸附、再溶解,再吸附的现象。被吸附剂吸附较弱的(即在展开剂中易溶解的)成分随展开剂移动较快;而被吸附剂吸附得较强的(即在展开剂中不易溶解的)成分,随展开剂移动较慢,从而得以分离,形成不同的斑点。根据样品中各成分的比移值(Rf值)与已知对照品比较进行定性鉴定。 比移值是薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值 。 又称Rf值,是色谱法中表示组分移动位置的一种方法的参数。定义为溶质迁移距离与流动相迁移距离之比。在一定的色谱条件下,特定化合物的Rf值是一个常数,因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。

在显色时,样品展开后,如果本身带有颜色,可以直接看到斑点的位置。对于无色的有机物可以采取以下两种方法显色:

(1)显色剂法:常用的显色剂有碘和三氯化铁水溶液等。许多有机化合物能与碘生成棕色或黄色的络合物。利用这一性质,在一密闭的容器中放入几粒碘,将展开并干燥的薄层板放入其中,稍稍加热,让碘升华,当样品与碘蒸气反应后,薄层板上的样品点处即可显示处棕色或黄色的斑点,取出薄层板用铅笔将点圈好即可。除饱和烃和卤代烃外,均可采用此法。三氯化铁水溶液可用于带有酚烃基化合物的显色。

(2)紫外光显色法: 用硅胶GF254制成的薄层板,由于加入荧光剂,在254nm波长的紫外灯下,可观察到暗色斑点,此斑点就是样品点。

薄层层析有许多优点:它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点,同时展开速率快,一般仅需15~20分钟;混合物易分离,分辨力一般比以往的纸层析高10~100倍,它既适用于只有0.01μg的样品分离,又能分离大于500mg的样品作制备用,而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外,在进行化学反应时,薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的

一种“预试”,常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。

【实验药品及仪器】

药品:硅胶GF254、水、羧甲基纤维素钠(CMC)、APC药片 、二氯甲烷、无水硫酸镁、

展开剂 :苯:乙醚:冰醋酸:甲醇=120:60:18:1。

仪器:玻璃棒、烧杯、洗瓶、锥形瓶、玻璃片、分液漏斗、表面皿、吹风机、广口瓶、电子天平 短波紫外分析仪、 鼓风干燥箱。

【实验操作】

1、硅胶薄层板的制备

(1)取洁净干燥的玻璃片5块,放在水平桌面上备用,称取3.0g硅胶GF254及

9.5mlCMC溶液于烧杯中,快速混合并搅匀。然后均匀的分到五块玻璃片上。用手指抬起玻片一端,另一只手轻轻敲打,使形成一均匀薄层,平放在水平玻板上。

(2)干燥,活化。

2、样品液的制备

将一片APC纸包碾碎至于小烧杯中,加入10ml水搅拌、静置。然后将上层液体倾至分液漏斗,再在分液漏斗中加入5ml的CH2Cl2,振摇、分层,分出有机层(下层)于干燥的锥形瓶中,加入少量的无水MgSO4除水,盖表面皿备用。

3、点样:

取硅胶GF254薄层板三块,在薄层板的一侧约1cm处,用铅笔标记一下。 用管口平整的毛细管分别在距离玻璃片下端1cm处的左侧滴上样品液(直径为1-2mm),然后再在三块层析板的右侧分别滴上三种不同的标准液,大约使同一层析板上的两点距离1cm且居中间。放置片刻用吹风机吹干薄层板的背面。

4、展开:

将点好样品的硅胶层析板放入盛有展开剂的层析筒中,(注意:切勿将点样处浸没于展开剂中进行密闭展开)。当展开剂前沿扩散到距顶端1厘米左右时,取出

薄层板,立即用铅笔划出溶剂前沿,然后置薄层板用吹风机吹干展开剂。然后放于紫外灯下观察,用铅笔标出暗点。

5、计算Rf值:

用直尺分别量出原点到斑点中心的距离和原点到展开剂前沿的距离,分别计算出每块层析板上的四个荧光点中心的Rf值,绘制每块板的原版图。

6、将废硅胶刮制垃圾袋,板洗净放回原处。

【数据处理】

公式:Rf=样品中某组分移动离开原点的距离 展开剂前沿距原点中心的距离

所以,由图一得:

1.252.513.90

Rf(1)=5.17=0.241 Rf(2)=5.17=0.485 Rf(3)=5.17=0.754

1.21

Rf(咖啡因)=5.17=0.234

︱0.241-0.234︱=0.007<0.05

因此,样品中含有咖啡因。

同理,由图二得:

1.252.613.81

Rf(1)=5.59=0.224 Rf(2)=5.59=0.470 Rf(3)=5.59=0.682

2.80

Rf(乙酰苯胺)=5.59=0.501

︱0.501-0.470︱=0.031<0.05

因此,样品中含有乙酰苯胺

同理,由图三得:

1.412.743.83

Rf(1)=5.11=0.276 Rf(2)=5.11=0.536 Rf(3)=5.11=0.750

3.94

Rf(乙酰水杨酸)=5.11=0.771

︱0.771-0.750︱=0.021<0.05

因此,样品中含有乙酰水杨酸。

【实验结果讨论】

实验中的Rf值于标准品中的Rf值有一定的出入,原因:

(1)APC药片中含有其他物质,在分离时影响所测物质。

(2)实验所用的薄层板是自己制作的,可能制作不均匀。

(3)实验过程中,气液没有达到平衡。

【注意事项】

1、调浆不宜过干或者过稀,否则,制版不均匀。铺板时,尽量将吸附剂铺均匀,不能有气泡或颗粒等。涂布厚薄一定要均匀,薄层的厚度约0.25mm,否则会影响分离的效果。

2、薄层板干燥后,再放入烘箱中进行活化,进一步除去水分。

3、点样用的毛细管必须专用,不得混用。

4、点样时,使毛细管液面刚好接触到层析板即可,切勿点样过重而使薄层破坏。一般点样的直径在1-2mm之间。

5、在干燥样品时,用吹风机吹其背面。

6、展开时,选用合适的展开剂至关重要。当一种展开剂不能将样品分离时,可以选用混合展开剂。

7、展开时,展开剂液面的高度应低于样品斑点,在展开过程中,当展开剂前沿至薄层板上边的终点线时,取出薄层板,立刻用铅笔标出展开剂前沿。

【心得体会】

 

第二篇:柱色谱,薄层色谱

实验七 柱色谱

计划学时: 3 学时

实验目的: 学习柱色谱的操作方法。

实验原理: (同实验六)

柱色谱(柱上层析)常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相;而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收较大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。 吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。 当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是形成了不同层次,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带,再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集;或将柱吸干,挤出后按色带分割开,再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。

实验装置及样品:

1 、装置图:(略)

( 1 )吸附剂

常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般要经过纯化和活性处理,颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言,粒度愈小表面积愈大,吸附能力就愈高,但颗粒愈小时,溶剂的流速就太慢,因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种:

酸性氧化铝 用 1% 盐酸浸泡后,用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮液 pH 为 4 ,用于分离酸性物质。 中性氧化铝 其悬浮液的 pH 为 7.5 ,用于分离中性物质。

碱性氧化铝 其悬浮液的 pH 为 10 ,用于胺或其它碱性物质的分离。

大多数吸附剂都能强烈地吸水,而且水分易被其它化合物置换,因此吸附剂的活性降低,通常有加热方法使吸附剂活化。氧化铝随着表面含水量的不同,而分成各种活性等级。

活性等级的测定一般采用勃劳克曼( Brockmann )标准测定法.

( 2 )溶质的结构与吸附能力的关系

化合物的吸附性与它们的极性成正比,化合物分子中含有极性较大的基团时,吸附性也较强,各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减:

酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 > 烯 > 饱和烃

在本实验中,乙酰二茂铁极性大于二茂铁,因此,二茂铁首先被洗脱下来。

( 3 )溶剂

溶剂的选择是重要的一环,通常根据被分离物中各化合物的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。 先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中,选用的溶剂极性要低,体积要小。如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小,则可加入少量极性较大的溶剂,使溶液体积不致太大。

色层的展开首先使用极性较小的溶剂,使最容易脱附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂,将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来。常用洗脱剂的极性按如下次序递增:

己烷和石油醚 < 环己烷 < 四氯化碳 < 三氯乙烯 < 二硫化碳 < 甲苯 < 苯 < 二氯甲烷 < 氯仿 < 乙醚 < 乙酸乙酯 < 丙酮 < 丙醇 < 乙醇 < 甲醇 < 水 < 吡啶 < 乙酸

所用溶剂必须纯粹和干燥,否则会影响吸附剂的活性和分离效果。

本实验所用溶剂为石油醚:乙醚= 3 : 1 的混合溶剂(学生自己配制)。

吸附剂色谱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱剂的选择,而且与制成的色谱柱有关:

( 1 )柱中的吸附剂用量为被分离样品量的 30 — 40 倍,若需要可增至 100 倍;

( 2 )柱高和直径之比一般是 75 : 1 ;

( 3 )装柱有湿法和干法两种,本实验采用湿法装柱,无论采用哪种方法装柱,都不用使吸附剂有裂缝或气泡。

2 、样品:粗制的乙酰二茂铁乙醚溶液

实验操作步骤:

1 、装柱(湿法)

用镊子取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底部,轻轻塞紧;再在脱脂棉上盖上一层厚 0.5cm 的石英砂,关闭活塞;向柱中倒入 3 : 1 石油醚 / 乙醚混合溶剂至约为柱高的 3/4 处,打开活塞,控制流出速度为滴 /s ;通过一干燥的玻璃漏斗慢慢加入色谱柱用中性氧化铝,并用橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部,使填装紧密(见【注释】),当装柱至 3/4 时,再在上面加一层厚 0.5cm 的石英砂(见【注释】)。操作时一直保持上述流速注意不能使液面低于砂子的上层(见【注释】)。

2 、加样品( 1ml 粗制的乙酰二茂铁乙醚溶液)

当溶剂液面刚好流至石英砂面时,立即沿柱壁加入 1ml 粗制的乙酰二茂铁乙醚溶液,当此溶液流至接近石英砂面时,立即用 0.5ml 乙醚洗下管壁的有色物质,如此连续 2 — 3 次,直至洗净为止。

3 、洗脱

用 3 : 1 石油醚 / 乙醚混合溶剂(学生自己配制)洗脱,控制流出速度如前。整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。

二茂铁因极性小首先向下移动,极性较大的乙酰二茂铁则留在柱的上端,形成不同的色带。当最先下行的色带快流出时,更换另一接受瓶,继续洗脱,至滴出液近无色为止,再换一接受瓶。

4 、回收洗脱液

将先洗脱的洗脱液倒入二茂铁溶液回收瓶中,而将后洗脱的洗脱液倒入乙酰二茂铁溶液回收瓶中。 实验关键步骤:

? 装柱要紧密,要求无断层、无缝隙。

? 在装柱、洗脱过程中,始终保持有溶剂覆盖吸附剂。

一个色带与另一色带的洗脱液的接受不要交叉。

柱色谱薄层色谱

一、 邻硝基苯胺和对硝基苯胺的分离

邻硝基苯胺由于形成分子内氢键,极性小于对硝基苯胺,对硝基苯胺可与吸附剂形成氢键,利用柱色谱可将二者分离。

1. 试剂

中性氧化铝,3 mL邻硝基苯胺和对硝基苯胺的苯溶液(此溶液由0.55 g对硝基苯胺和0.7 g邻硝基苯胺溶于100 mL苯中配成)

2. 操作

用中性氧化铝和适量的无水苯按照上述方法制备色谱柱。

当苯的液面恰好降至氧化铝上端的表面上时,立即用滴管沿柱壁加入3 mL邻硝基苯胺和对硝基苯胺混合液。当溶液液面降至氧化铝上端表面时,用滴管滴入苯洗去沾附在柱壁上的混合物。然后在色谱柱上装置滴液漏斗,用苯淋洗,控制滴加速度如前,直至观察到色层带的形成和分离。当黄色邻硝基苯胺色层带到达柱底时,立即更换另一接受器,收集全部此

色层带。然后改用苯-乙醚(体积比1:1)为洗脱剂,并收集淡黄色对硝基苯胺色层带。

将收集的邻硝基苯胺的苯溶液和对硝基苯胺的苯-乙醚溶解分别用水泵减压蒸去溶剂,冷却结晶,干燥后测定熔点。邻硝基苯胺和对硝基苯胺的熔点分别为71~71.5℃,147~148 ℃。

本实验约需5 h 薄层色谱

二、 镇痛药片APC组分的鉴定

普通的镇痛药如APC通常是几种药物的混合物,大多含阿斯匹灵、咖啡因和其它成分,由于组分本身无色,需要通过紫外灯显色或碘熏显色,并与纯组分的Rf值比较来加以鉴定。

1. 试剂

APC镇痈药片,2%阿斯匹灵的95%乙醇溶液,2%咖啡因的95%乙醇溶液,95%乙醇,12:1的1,2-二氯乙烷-乙酸溶液

2. 操作

(1) 样品液的制备

取1片镇痛药APC研成粉状。用棉球塞住1支滴管的细口,将粉状APC转入其中堆成柱状,用滴管从上口加入5 mL 95%乙醇通过柱状的镇痛药粉,萃取液收集于小试管中。

(2) 点样

取2块制备好的薄层板,分别在距一端1 cm处用铅笔轻轻划一横线为起始线。用毛细管在一块板的起始线上点萃取液和2%的阿斯匹灵乙醇溶液两个样点,在第二块板的起始线上点萃取液和2%的咖啡因乙醇溶液两个样点。样点间距1~1.5 cm,样点直径在2 mm内。

(3) 展开

待样点干燥后,小心放入已加入展开剂(12:1的1,2-二氯乙烷-乙酸溶液)的250 mL广口瓶中进行展开。瓶的内壁贴一张高5 cm环绕周长约4/5的滤纸,下面浸入展开剂中0.5 cm,盖好瓶塞,展开剂前沿上升至离板上端1 cm处取出,尽快用铅笔在展开剂前沿划一记号。

(4) 鉴定

将烘干的薄层板放入254 nm紫外分析仪中照射显色,可清晰地看到粉红色亮点,说明APC药片中3种主要成分都是荧光物质。用铅笔绕亮点作出记号,计算每个点的Rf值。并与标准样品比较,如测定值和参考值误差在20%以下,即可肯定为同一化合物。如误差超过20%,则需重新点样并适当增加展开剂中醋酸的比例。

再将层析板置于放有几粒碘结晶的广口瓶内,盖上瓶盖,直至暗棕色的斑点明显时取出,并与先前在紫外分析仪中用铅笔作出的记号进行比较。

NHCOCH3

CONH2

OH

COOH

OCOCH3

O

OCH2CH3

O

H3C

NCH3

CH3OHNHCOCH3

水杨酰胺 阿斯匹灵 菲那西汀(Rf = 0.46) (Rf= 0.36) (Rf = 0.25) 咖啡因 扑热息痛(Rf = 0.27) (Rf = 0.06)

展开剂如果过多,会有何后果?(可能会淹没所画出来的细线,从而溶解所点的样) 如果斑点出现拖尾现象,这可能是身原因?(所点的试样的样点的圈太大)

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