实验报告

课程名称：生化实验B 实验日期：

班级： 姓名学号：

血红蛋白凝胶过滤

一、 背景及目的

血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。

凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。 凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度

2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH

6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。

影响凝胶过滤的因素主要有：

1、 层析柱的选择 ：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。

2、 加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。

3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。

4、 洗脱速度：洗脱速度应保持适中。

目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：

1、脱盐 2、用于分离提纯 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 5、蛋白质的复性

二、 实验原理

层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。按操作形式可以划分为：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。按层析的机理可以划分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。2

凝胶过滤是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱，大分子不能进入凝胶颗粒的静止相中，只能在凝胶颗粒间随流动相移动，因而可以被较快洗出，而小分子则能够自由进出凝胶颗粒，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此需要花费较长时间流经柱床，从而使不同大小的分子得到分离。

本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形1

21 百度百科 凝胶过滤层析 /view/81744.htm 百度百科 层析 /view/15375.htm#2

象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。

本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼就可以检验分离效果。

三、 仪器与试剂、实验材料

1、 仪器

⑴ 层析柱 ⑵ 恒流泵（HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂） ⑶ 胶头滴管

⑷ 50ml烧杯 3个 ⑸ 玻璃棒

2、 试剂

⑴ 磷酸缓冲液（老师已配好）

⑵ 还原层试剂 （1:1的40nM FeSO4和80 mMNa2H2EDTA,0.2MNaHPO4, ,老师提供）

⑶ Sephadex G-25

3、 实验材料

血红蛋白样品（1ml抗凝血加10ml pH7的20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，浓度达5mg/ml，老师提供）

四、 实验步骤

1、 凝胶溶胀：老师已准备好

2 、 检验： 旋上层析柱下端柱帽，加少量去离子水，看水是否顺利流出，如果流速过缓，用洗耳球自上端吹气，使其畅通。上下端倒置，按上述步骤检验。

3、 装柱及平衡：取下上端柱帽，装入5cm左右的洗脱液，溶胀好的凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开始洗脱，使柱中的凝胶一直处在溶液中，装柱长15cm左右。溶液液面应该高于凝胶面3-5cm，防止凝胶因脱水而毁柱。实验中沉降完成后，液面高于凝胶面4cm左右。此时观察柱面，上下均一，无界面，裂隙。旋上上端柱帽，细管管接上磷酸盐缓冲液，下端柱帽的细管接恒流泵，开始平衡洗脱。过程中调节好流速，6滴/分。平衡过程20分钟。

4、 上样：事先剪好略小于层析柱内径的滤纸片，打开上柱帽，将滤纸片放入层析柱中，使其自然飘落覆盖在凝胶面上，防止上样时液滴对床面的冲击。确定流速后准备上样。利用恒流泵排气键加速洗脱，直至洗脱液面与胶床液面相切，停止洗脱。用滴管加0.7ml还原试剂，小心注入胶床液面中央。开始洗脱，待液面与凝胶床面相齐时，关泵。上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。上0.7ml血红蛋白样，开泵，至液面与胶面相齐，关泵。上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。上5ml的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化钾。

5、 待黄色液体全部流出，开排气键，加速洗脱10分钟

五、 结果

1、实验现象

还原层上样时，溶液呈黄色，当还原液面与凝胶床面相切时，床面以下两厘米左右呈现黄色。

加上褐色的血红蛋白样品时，开启泵。此时褐色下渗，在未加入缓冲液之前，褐色带下端已经开始变为暗红色。层析柱上的色带由上至下依次为黄色，褐色，暗红色。

当上5ml缓冲液并开始洗脱时候，褐色全部变为暗红色，红色带下端颜色变浅。此时即为两个色带，上端黄色下端暗红。

开始洗脱七分钟时，暗红带下端开始变鲜红色，随时间推移，暗红带全部转变为鲜红色。

过程中，红色带在下，黄色带在上。两色带一直下移。色带边界不是很清晰，而且与其他组的同学相比，鲜红色较浅。

随色带的下移，两色带间距变大。

当开始流出红色液体时，用小烧杯接收，待红色全部流出用了30分钟。

当开始有黄色液滴流出时，用小烧杯接收，黄色液体全部流出用了7分钟。

2、 现象解释

血红蛋白样品中的铁离子最初为三价，显褐色。当经过还原带时，三价铁被还原成二价，生成暗红色的还原型血红蛋白。还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧气结合生成鲜红色的氧合血红蛋白。

血红蛋白分子量很大，分子直径大，不能进入凝胶孔穴内部，只能在凝胶颗粒间移动，所以洗脱速度较快。而铁氰化钾分子量小，分子直径小，能够进入凝胶颗粒孔穴内部，故洗脱速度较慢。

3、 凝胶过滤效果

相比于其他组的实验现象，我们组的效果不是太好。刚开始的时候，两个色带分离效果不好，没有形成比较清晰的界限，但在最后终于是分开了，而且随着时间的推移，两色带间距拉大。理论上讲，两色带的间距应该保持不变，间距变大的原因，可能是胶床面上的滤纸片没有放平，而且床柱的内部有裂隙，在外部无法观察到。

最后变成的鲜红色带相对颜色较浅，分析原因，是因为在加血红蛋白样品时没有震动试管，而血红蛋白分子又容易沉降，导致加入的血红蛋白样品较少。

六、 思考题

总结分析柱层析技术操作的关键步骤和操作要领和技巧。

1、 装柱。如果装柱不均匀（没有填严实），使得柱子出现太多气泡，导致分离效果不好。湿法装柱比干

法装柱效果要好。

这就要求在湿装时，要边搅拌边加入填柱料（硅胶或凝胶）。而干法装柱时则要注意密实程度。填完后应该从侧面敲打，使床柱更密实。

要求柱面上下均一，无界面，裂隙。

装柱后加滤纸片的时候应使其自然飘落在凝胶液面上。

2、 恒流泵流速。根据实验要求的不同要选择不同的流速。像本次试验要求流速6滴/分，如果过快的话，

分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。如果过慢，则耗

时太长。

3、 上样。上样的时候每次加样之前一定要停止洗脱。否则很可能造成液面到达胶面以下而毁柱。另外加

样的时候要用滴管把液体送到接近滤纸的地方再轻轻滴加，防止液体冲击对胶面造成影响。

七、 参考文献

1 、 百度百科 凝胶过滤层析

2 、 百度百科 层析 /view/15375.htm#2

3 、 赵武玲主编，《基础生物化学》，中国农业大学出版社，20xx年9月第一版

4 、 有参考胡老师课件

八、 实验小结

这次实验差点就失败了，应该是装柱的时候出了点问题，而在取血红蛋白样品的时候也没有提前摇匀。 实验前应该多考虑，多思考，并在实验中注意团队合作。

老师在实验前讲了好多道理，给了我们很大的启发。我喜欢这样不单单教授理论知识的老师。

在实验之前老师提出了一个问题，血红蛋白中的亚铁离子为什么不会被氧气氧化。查了好多资料，可惜看不太懂，无法理解，还是自己的基础知识没有学充分啊。

 

第二篇：验血报告单

如何看验血报告单？

因为人在生病时，血液中各种细胞的数量会发生变化。比如贫血时，红细胞的数量或血红蛋白的含量就会产生变化；身体发生炎症时，白细胞的数量就会增加。

1. 红细胞计数(RBC)和血红蛋白测定(HGB)

2. 白细胞计数(WBC)和白细胞分类计数(DC)

3. 血小板计数(PLT)

血红蛋白测定(HGB)

成年男性：120～160g/L

成年女性：110～150g/L

新生儿：170～200g/L

青少年（儿童）：110～160g/L

红细胞和血红蛋白增多

血红蛋白

1．相对性增多：

由于某些原因使血浆中水分丢失，血液浓缩，使红细胞和血红蛋白含量相对增多。如连续剧烈呕吐、大面积烧伤、严重腹泻、大量出汗等；另见于慢性肾上腺皮质功能减退、尿崩症、甲状腺功能亢进等。

2．绝对性增多：

由各种原因引起血液中红细胞和血红蛋白绝对值增多，多与机体循环及组织缺氧、血中促红细胞生成素水平升高、骨髓加速释放红细胞有关。

（1）生理性增多：见于高原居民、胎儿和新生儿、剧烈劳动、恐惧、冷水浴等。

（2）病理性增多：由于促红细胞生成素代偿性增多所致，见于严重的先天性及后天性心肺疾病和血管畸形，如法洛四联症、紫绀型先天性心脏病、阻塞性肺气肿、肺源性心脏病、肺动-静脉瘘以及携氧能力低的异常血红蛋白病等。

在另一些情况下，病人并无组织缺氧，促红细胞生成素的增多并非机体需要，红细胞和血红蛋白增多亦无代偿意义，见于某些肿瘤或肾脏疾病，如肾癌、肝细胞癌、肾胚胎瘤以及肾盂积水、多囊肾等。

红细胞和血红蛋白减少

一般成年男性血红蛋白<120g/L,成年女性血红蛋白<110g/L为贫血。根据血红蛋白减低的程度贫血可分为四级。轻度：血红蛋白>90g/L、中度：血红蛋白90～60g/L、重度：血红蛋白60～30g/L、极度：血红蛋白<30g/L。

1．生理性减少：

3个月的婴儿至15岁以前的儿童，因生长发育迅速而致造血原料相对不足，红细胞和血红蛋白可较正常人低10%～20%。妊娠中、后期由于孕妇血容量增加使血液稀释，老年人由于骨髓造血功能逐渐减低，均可导致红细胞和血红蛋白含量减少。

2．病理性减少：

（1）红细胞生成减少所致的贫血：

1）骨髓造血功能衰竭：再生障碍性贫血、骨髓纤维化等伴发的贫血。

2）因造血物质缺乏或利用障碍引起的贫血：如缺铁性贫血、铁粒幼细胞性贫血、叶酸及维生素B12缺乏所致的巨幼细胞性贫血。

（2）因红细胞膜、酶遗传性的缺陷或外来因素造成红细胞破坏过多导致的贫血，如遗传性球形红细胞增多症、地中海性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、异常血红蛋白病、免疫性溶

血性贫血、心脏体外循环的大手术及一些化学、生物因素等引起的溶血性贫血。

（3）失血：急性失血或消化道溃疡、钩虫病等慢性失血所致的贫血

红细胞计数(RBC)

[正常参考值]

男：4.0×10 12-5.3×10 12个/L(400万-550万个/mm3)。

女：3.5×10 12-5.0×10 12个/L(350万-500万个/mm3)。

儿童：4.0×10 12-5.3×10 12个/L(400万-530万个/mm3)。

[临床意义]

红细胞减少多见于各种贫血，如急性、慢性再生障碍性贫血、缺铁性贫血等。 红细胞增多常见于身体缺氧、血液浓缩、真性红细胞增多症、肺气肿等。

HCT（红细胞比容）

正常范围

男性 40%～54%；女性 37%～47%；新生儿 48%～68%。

血细胞比容测定的临床意义基本同红细胞计数或血红蛋白测定，常用作贫血诊断和分类的指标。还可用于临床决定病人是否需要补液的实验检查依据。通常以HCT30%-35%为出现缺氧临界值，此时除输入晶体液及胶体液外，还应输入CRBC

1. 红细胞平均血红蛋白量(MCH)

新生儿 35～43pg 儿童 33～37pg 成人 26～32pg 。

化验结果意义:ＭＣＨ检查主要用于贫血的鉴别。正细胞性贫血者ＭＣＨ正常，大细胞性贫血＞32pg，单纯小细胞性贫血及小细胞性低色素性贫血＜26pg。

2. 红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC) 正常值 血细胞自动分析仪：320～360g/L （32%～

36%）。

化验结果临床意义

（1）升高：高色素性贫血、严重呕吐、频繁腹泻、真性红细胞增多症、慢性一氧化化碳中化碳中毒、心力衰竭等。

（2）降低：小细胞低色素性贫血。

附注:根据RBC、HGB、HCT的测定结果分别计算求得MCV、MCH和MCHC，前三项通过实验直接测定的结果，必须准确可靠，后三项才有意义。

相关疾病:腹泻、真性红细胞增多症、一氧化碳中毒

3. 平均红细胞体积(MCV)

正常值：80～94fl (80～94μm3)。

化验结果意义：(1)增多：大细胞性贫血。(2)减少：小细胞性低色素性贫血。

4. 白细胞数；WBC 成人：（4.0～10.0）×109/L

化验结果临床意义

（1）增高：急性化脓性感染（脓肿、脑膜炎、肺炎、阑尾炎、扁桃体炎等），某些病毒感染（传染性单核细胞增多症，流行性乙型脑炎），白血病，类白血病反应，糖尿病酮症酸中酮症酸中毒，严重烧伤，急性大出血，恶性肿瘤及某些金属（如铅、汞等）中毒。生理性增高见于新生儿，月经期，分娩，情绪变化及注射肾上腺素后等。

（2）减少：某些传染病（伤寒、副伤寒、黑热病、疟疾、病毒性肝炎、沙门菌属感染等），某些血液病（再生障碍性贫血、非白血性或亚白血性白血病），自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮等），脾功能亢进、各种原因所致的脾肿大（如门脉肝硬化、班替综合征等），粒细胞缺乏症，恶性组织细胞病，阵发性睡眠性血红蛋白尿，慢性理化损伤，电离辐射（如X线等），肿瘤化疗及某些药物（磺胺、氯霉素）反应等。

血小板计数(PLT)

[正常参考值]

100×109-300×109个/L(10万-30万个/mm3)。

[临床意义]

血小板计数增高见于血小板增多症、脾切除后、急性感染、溶血、骨折等。

血小板计数减少见于再生障碍性贫血、急性白血病、急性放射病、原发性或继发性血小板减少性紫癜、脾功能亢进、尿毒症等。