实验一二苯基乙二酮的制备及薄层色谱
一、实验目的
1. 学习安息香氧化制备α—二酮的原理与方法。
2. 掌握薄层色谱的原理,薄层板的制作。
3. 学习薄层色谱法跟踪反应进程。
二、基本原理
(一)制备二苯基乙二酮的原理
(二)薄层色谱的相关知识
1.薄层色谱的原理
薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用“TLC”表示。其原理概括起来是:由于混合物中的各个组分对吸附剂(固定相)的吸附能力不同,当展开剂(流动相)流经吸附剂时,发生无数次的吸附和解吸过程。吸附能力弱的组分随流动相迅速向前移动,吸附能力强的组分滞留在后。由于各组分具有不同的移动速率,最终得以在固定相薄层上分离。
2.薄层色谱常用的吸附剂
(1)薄层吸附色谱的吸附剂最常用的是硅胶和氧化铝。
(2)硅胶是无定形多孔性物质,略具酸性,适用于酸性或中性物质的分离。
(3)薄层色谱用的硅胶分类:
硅胶 H — 不含粘合剂;
硅胶 G — 含煅石膏粘合剂;
硅胶 HF254 — 含荧光物质,可在波长254nm紫外光下观察荧光;
硅胶 GF254 — 既含煅石膏又含荧光剂。
(4)粘合剂:煅石膏(CaSO4 · ½ H2O)、淀粉、羧甲基纤维素钠(CMC)
加粘合剂的薄层板称为硬板,不加粘合剂的薄层板称为软板。
3.薄层板的制备
薄层板分为干板和湿板。薄层应尽量均匀而且厚度(0.25~1mm)要固定。否则,展开时溶剂前沿不齐,色谱结果页不易重复。湿板的制法有“平铺法”和“浸渍法”两种。
常用的是一种简易平铺法:
(1)铺板:取硅胶粉与0.5~1%的CMC水溶液在烧杯中调成糊状(不要用力过大、过快,以免产生气泡),迅速铺在清洁干燥的载玻片上,用玻璃棒将其涂满整块玻璃片,用手轻轻振摇玻璃片,使表面均匀平滑,放在水平台上,室温下晾干后进行活化。
(2)活化:烘箱要慢慢升温,硅胶板一般在105~110℃恒温30min 。
4.点样
通常将样品溶于低沸点溶剂(丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳等)配成1%溶液,用内径小于1mm、管口平整的毛细管点样。
点样前,在距薄层板底端约1 cm处,用铅笔轻轻划一条横线,作为起始线。然后用毛细管吸取样品溶液,垂直地轻轻接触到薄层板的起始线上。点样要轻,不可刺破薄层。
(1)斑点直径一般不超过2mm。
(2)因溶液太稀,一次点样不够,如需重复点样,则应等前次点样的溶剂挥发后方可重点,以免样点过大,造成拖尾、扩散等现象,影响分离效果。
(3)若在同一块板上点多个样,样点间距应为1~1.5cm。
(4)点样结束待样点干燥后,方可进行展开。
(5)样品太少时,斑点不清楚,难以观察,但样品量太多时,易造成斑点过大,互相交叉或拖尾,以致不容易分开。
5.展开
将选择好的展开剂放在层析缸中,使层析缸内空气饱和,再将点好样品的薄层板放入层析缸中进行展开。
使用足够的展开剂以使薄层板底部浸入溶剂3~5 mm,但溶剂不能太多,否则样点在液面以下,溶解到溶剂中,不能进行层析。
当展开剂上升到薄层板的前沿(离顶端5~10mm处)或各组分已明显分开时,取出薄层板,立即用铅笔划出溶剂前沿的位置,找出各斑点。根据比移值(Rf )的不同对各组分进行鉴别。
6.显色
(1)直接观察:展开后,如果化合物本身有颜色,就可直接观察它的斑点。
(2)紫外灯下观察:很多有机物本身无色,可在紫外灯下观察有无荧光斑点,圈出斑点位置。
(3)碘薰法:薄层板的溶剂挥发后,放在含有0.5g 碘的密闭容器中。碘与展开后的有机化合物可逆地结合,在数秒钟内化合物斑点呈黄棕色。色谱板在展开缸内取出后,呈现的斑点在2~3s内消失,因此,必须立即用铅笔标出化合物位置。
(4)显色剂显色:一般的显色剂,还有腐蚀性的显色剂,如浓硫酸、浓盐酸、浓磷酸等。
7.比移值的测定
比移值(R f) 表示物质移动的相对距离,即展开后样品点到原点的距离和溶剂前沿到原点的距离之比,常用分数表示。 R f 值与化合物的结构、薄层板上的吸附剂、展开剂、显色方法和温度等因数有关。但在上述条件固定的情况下,R f 值对每一种化合物来说是一个特定的数值。当两个化合物具有相同的R f 值时,在未做进一步的分析之前不能确定它们是不是同一个化合物。在这种情况下,简单的方法是使用不同的溶剂或混合溶剂来作进一步的检验。
Rf=
式中:a为溶质由点样中心到展开后溶质最高浓度中心的距离;b为有点样中心到展开剂前沿的距离。
三、实验准备
1.试剂:二苯基羟乙酮2.2g(0.01mol),冰醋酸10ml,三氯化铁5.5g,70%乙醇。
2.仪器:100ml三口烧瓶,球形冷凝管,锥形瓶,布氏漏斗,吸滤瓶,红外光谱仪,液相色谱仪,显微熔点测定仪。
3.物理常数:
四、仪器安装要点
五、实验操作
(一)薄层板的制作及活化:每人制两块硅胶板
1. 选用2.5´7.5(cm)规格的玻璃板两块,用肥皂水洗净,用蒸馏水淋洗两次后烘干,用时再用酒精棉球擦除手印至对光平放无斑痕。
2. 称取 2g 硅胶GF254,边搅拌边慢慢加入到盛有4~5mL 0.3% CMC溶液的烧杯中,调成糊状,平铺在玻璃片上。(注意:专用量筒量取,药匙不要混用,制作薄层板的烧杯,玻璃钉不要挪作他用,防止污染薄层板)
3. 晾干后放入105~110℃ 烘箱内烘30分钟(活化)。
(二)二苯基乙二酮的制备
1.反应
采用薄层色谱跟踪反应进程(展开剂:二氯甲烷):
检查确认反应结束后:
(1)在反应瓶中加入50mL水,加热至沸腾,冷却,即有黄色固体析出(注意:一定要冷却充分,以减少损失)。
(2)过滤,得到粗产物
2.提纯
用70%乙醇40mL重结晶(活性炭脱色),得到淡黄色针状晶体。 (溶解时用加热回流装置)
3.数据处理
(1)计算各个样点的比移值Rf
(2)测定产品熔点及红外光谱。
六、实验提问
(1)除本实验用到的FeCl3外,还有哪些氧化剂可以用来制备二苯基乙二酮,这些氧化剂有哪些优缺点?
一.硝酸氧化法。用硝酸氧化法较为方便,但反应中会释放出二氧化氮,对环境产生污染
二.醋酸铜氧化法。安息香可以被温和的氧化剂醋酸铜氧化生成a-二酮,铜盐本身被还原成亚铜态。实验经改进后使用催化量的醋酸铜,反应中产生的亚铜盐可不断被硝酸铵重新氧化成铜盐,硝酸本身被还原为亚硝酸铵,后者在反应条件下分解为氮气和水。改进后的方法在不延长反应时间的情况下可明显节约试剂,且不影响产率及产物纯度。
三.三氯化铁氧化法。避免常用的硝酸氧化法中产生有毒的氮的氧化物,而且收率高、质量好、操作方便、安全。
(2)本实验中,加入醋酸的目的是什么?
这个反应是一个氧化还原反应,冰醋酸既作为一个溶剂,也作为一个酸性介质提供者。
① 三氯化铁在酸性介质中能够发挥最强的氧化性。
② 三氯化铁极易水解,如果不在酸性介质中会水解为氢氧化物,无法发挥氧化剂的作用。
参考文献
[1]单尚,强根荣,金红卫.新编基础化学实验(Ⅱ)——有机化学实验[M].第二版.北京:化学工业出版社,2014:98,100.
薄层色谱法学习总结
李彬瑶
一、薄层色谱的功能
从19xx年俄国植物学家цвет提出色谱方法以来,已有100多年的历史。色谱方法根据其作用原理不同可分为吸附色谱、分配色谱和离子交换色谱。根据其使用方法不同又可分为纸色谱、薄层色谱和柱色谱。
薄层色谱法(Thin Layer Chromatography,即TLC)是色谱方法的一个重要分支。TLC具有诸如设备简单;操作容易;分离快速;灵敏度高(检测限达到0.1 ng-0.01 ng);可同时分析多个样品;变更层析条件方便等特点。因此TLC被广泛地应用于有机化学,无机化学,药物化学,生物化学等众多研究领域。以下为常见TLC的用途。
1.1 分离鉴定:
根据样品斑点和标准对照物的Rf值(及斑点颜色)鉴定化合物。也可以利用薄层色谱扫描仪对薄层板上化合物斑点进行原位扫描,得到TLC吸收光谱。这种光谱与化合物的结构有关,所以可用这些吸收光谱鉴定化合物。
1.2 纯度检查:
用TLC检查物质的纯度是一个有效的简便方法,并可确定杂质的含量。能用来检查重结晶、蒸馏等纯化方法的效果。根据层析谱中杂质斑点的出现情况,可判定是否有杂质以及杂质的含量多少。
1.3 监测化学反应
化学工作者进行化学反应时需要了解最佳反应条件,判定什么时候反应已到达终点;分析反应产物,选择合适反应条件。
1.4 检查稳定性
利用“对角线”TLC可以检查化合物的稳定性,“对角线”TLC是两次展开都用同一展开剂的双向展开。第一次展开后,样品组份经光、热或化学试剂处理,溶剂不变,转90°进行第二次展开。稳定的化合物(斑点)在对角线上,不稳定的化合物则偏离对角线。
1.5 定量分析
(1)洗脱后定量法:样品在薄层板上层析后,用适当溶剂将化合物(斑点)洗下再用适当的测定方法定量分析。
(2)原位色谱扫描法:利用各种扫描仪,对薄层板上斑点直接扫描定量。
1.6 确定柱色谱中洗脱液组分
柱色谱分离有机合成或天然产品时,常用TLC确定其洗脱液中无色组份。分步接收各份洗脱液,并用TLC鉴定结果。
二、薄层色谱的简介
薄层色谱是将吸附剂或支持剂均匀地铺在一块玻璃上,形成薄层。把要分离的样品点在薄层上,然后用适宜的溶剂展开,使混合物得以分离的方法。由于分离在薄层上进行故而得名。根据分离的原理不同,薄层色谱可以分为两类:用吸附剂铺成的薄层所进行的分离为吸附薄层色谱,吸附薄层色谱中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶;用纤维素粉、硅藻土等支持剂铺成的薄层进行分离的,属于分配薄层色谱。
吸附TLC:固定相为吸附剂(氧化铝、硅胶)。
分配TLC:固定相为液态(通常为水),固定相吸附在支持剂上。
2.1 吸附薄层的基本原理
吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同,及展开剂对它们的解吸附能力的不同,使各成分达到分离的。吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力,还受被吸附成分的性质影响,更与展开剂的性质有关。
要设计出合理有效的层析条件,必须熟悉薄层层析条件选择的基本要领。薄层层析的三项基本构成物质是:样品组分、吸附剂、展开剂。摸索层析条件,实际上是协调上述三者的关系。一切层析都是针对分析任务,也就是待分离的样品,寻求一种能够有效分离样品组分的配合方案。
2.2 薄层层析中的三要素
2.2.1 概述
基本思路是根据待分离样品组分的极性来确定吸附剂的极性和展开剂的极性。要协调、处理好吸附剂、展开剂、及被分离成分三者之间的关系,才能得到理想的薄层层析结果。
2.2.2 吸附剂
对吸附剂的基本要求是颗粒细致(薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂/支持剂的粒度更细,一般应小于250目,并要求粒度均匀)、大小均匀(亦即有较大的表面积和适当的吸附活性);不能与样品组分、样品溶剂、展开剂发生化学反应;更不能与溶剂及展开剂发生溶解。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高,以Ⅱ~Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定,薄层粒度越细,展开距离相应缩短,一般不
超过10厘米,否则可引起色谱扩散影响分离效果。
最常用的吸附剂是氧化铝和硅胶。
(1)氧化铝:
国产层析用氧化铝有碱性、中性、酸性三种,以中性氧化铝应用较广。 特点:氧化铝为吸附力较强的极性吸附剂,它适用于中性或者碱性的亲脂性化合物的分离。通常氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关。含水越多,吸附活性越小,吸附能力越小。
(2)硅胶:
表达式为mSiO2﹒nH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质,它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基,这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。
特点:
A.硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱,其吸附活性也与含水量呈负性相关。
B.硅醇基显较弱的酸性,因而,硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离,对有机酸、挥发油、萜类、皂苷、黄酮、蒽醌、氨基酸等成分的分离适用,不能用于生物碱等碱性物质的分离。
, C.由于结构的决定作用,氧化铝的活化温度可以很高(150 oC-160 oC)
而硅胶的活化温度却不能太高(105oC-110oC)。一旦超过500oC,硅醇基会相互脱水而失活。
根据样品的酸碱性和极性大小确定了吸附剂以后,正确选择展开剂也是保证较好分离的重要条件。
2.2.3 展开剂
薄层层析中用来将样品展开的溶剂。用极性适当的溶剂浸润已经点了样品的薄层板一端,凭借毛细作用带动样品在薄层板上移动,最终使样品分离的操作过程。展开剂常是由两种或者两种以上的溶剂按一定的比例组成的溶剂系统。
2.2.4 被分离成分
分析任务所要完成分离的样品中的有效成分。被分离成分的极性决定于其母核结构类型及官能团极性。如果吸附剂活性和展开剂活性固定不变的条件下,被分离成分的极性越大,吸附剂对其作用越强,展开距离越短;被分离成分极性越弱,吸附剂对其作用越大,展开距离越大。
总之,选择层析条件时,必须针对样品中被分离成分的极性,试行判断或确定吸附剂种类和活性,再探索配制展开剂。根据样品、展开剂、被分离物质三方面综合考虑。
三、实验室中薄层层析的操作步骤:
3.1 切割薄板
通常,买来的硅胶板都是方形的玻璃板,必需用钻石头玻璃刀按照所需的形状进行切割。在切割玻璃之前,用尺子和铅笔在薄板的硅胶面上轻轻地标出基线的位置(注意不要损坏硅胶面)。借助锋利的玻璃切割刀和一把引导尺进行玻璃切割。
3.2 选取合适的溶剂体系
在吸附薄层中,化合物在吸附薄层上移动的速度与展开剂的极性有关。展开剂的极性越大,化合物移动的速度越快,展开剂的极性越小,化合物的移动速度越慢。薄层层析要得到较好的展开效果,必须依据所要分离的样品来正确选择层析条件,对样品的极性进行认真研究,以确定适宜的吸附剂、展开剂。当吸附剂活度为一定值时,对多组分的样品能否获得满意的分离,决定于展开剂的选择。通常先用单一溶剂展开,根据被分离物质在薄层上的分离效果,进一步考虑改变展开剂的极性。
常用溶剂的极性从小到大排列顺序如下:
石油醚,环己烷,四氯化碳,甲苯,二氯甲烷,丙酮,乙酸乙酯,乙醇,乙酸,水。
使用单一溶剂,往往不能达到很好的分离效果,使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂,高极性的溶剂还有增加区分度的作用。
展开剂的比例要靠尝试。一般首先尝试文献中报道的该类化合物所使用的展开剂,然后不断尝试不同比例,直到找到一个分离效果好的展开剂。展开剂的选择条件:(1)对所需成分有良好的溶解性;(2)待分离物各组分之间的Rf在0.2~0.8之间;(3)不与待测组分或吸附剂发生化学反应;(4)沸点适中,黏度较小;(5)展开后组分斑点圆且集中;(6)混合溶剂最好用新鲜配制。对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质,在展开剂里往往加一点点三乙胺,氨水,吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。选择所添加的碱性物质,还必须考虑容易从产品中除去,氨水无疑是较好的选择。
3.3 将选定的展开剂倒入展开池中,使其刚好没过薄层板边缘为宜。盖好盖子,使展开池中展开剂达到饱和。
3.4 将化合物在标记过的基线处进行点样
点样是将经处理后的样品点加在薄层的特定部位,这是一项需要十分仔细的操作步骤,点样的好坏会直接影响分离效果。
用毛细管(0.5 mm以下)或用专业点样器进行点样。在点样时食指放在点
样管的上端,当点样管的下端与硅胶板接触的瞬间轻轻松动上端的食指,溶液自然从点样管出来,迅速提起点样管,反复操作。得到小且均匀的样点。样品溶液不能太浓,浓度过大,样品不能被硅胶很好的吸收,不利于分离。样点位置应在距离底边1/10处;点间距离至少为样点直径的2倍;点样量适当;样点直径小于2 mm。
薄层层析点样方法应注意以下几点:
(1)样品最好用具挥发性的有机溶剂溶解,不应用水溶液,因水分子与吸附剂的相互作用力较弱,当它占据了吸附剂表面上的活性位置时,就使吸附剂的活性降低,而使斑点扩散。
(2)在制备样品时,溶样溶剂黏度不能过高,以便于点样。
(3)先在TLC点上不同量的样品,并展开、显色后观察分离情况,以此确定最佳样品用量。
(4)为避免不同定量毛细管的点样误差,建议一块薄层板上最好用同一只毛细管。但应注意更换样品时,应将毛细管用超声波或不同极性溶剂清洗干净。
3.5 展开
当样点上的溶剂充分挥干后,将薄层板放置于展开池中,使适当的展开剂从薄层的一端向另一端进行浸润展开至90%的薄板长度。
密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等;展开方式有上行法、下行法之分,展开方向有单向、双向、多次展开等。先悬空饱和、再入液展开(若容器中展开剂未达到饱和,由于混合展开剂内含有几种挥发性试剂,致使薄层板边缘与中间的试剂比例不同,因此样品在边缘和中间展层的距离也不同,这种现象称为边缘效应,严重时会影响分离效果)。样点不能泡在展开剂中;薄层浸入时不能歪斜进入。
3.6 从展开池中取出薄板并且标注溶剂前沿位置。
3.7 显色
待薄板上的溶剂挥发掉后。用适当的方法或者适当的显色剂处理薄层,使其上可能已经分离的各成分斑点显示出来,以方便计算各个斑点的比移值,从而提供定性与定量的依据。
显色的基本步骤是:一看、二照、三碘、四显,荧光背景也常见。
(1)首先在日光下观察,划出有色物质的斑点位置
(2)将薄板放在紫外灯下,观察有无暗斑或荧光斑点。用铅笔标出所有有紫外活性的点。
(3)观察化合物是否会吸附碘可逆的产生棕色或黄色斑点。
(4)荧光薄板检测,观察荧光薄板中是否出现暗斑。
(5)当化合物为既无色又无紫外吸收的物质,则采用显色剂显色的方法。使用显色剂时,将干燥的薄板用镊子夹起并放入染色剂中,确保从基线到溶剂前沿都被浸没。用纸巾擦干薄板的背面。将薄板放在加热板上观察斑点的变化。在斑点变得可见而且背景颜色未能遮盖住斑点之前,将薄板从加热板上取下。
3.7.1 通用与专用显色剂
显色剂可以分成两大类:一类是检查一般有机化合物的通用显色剂;另一类是根据化合物分类或特殊官能团设计的专属性显色剂。
3.7.1.1 通用显色剂
(1)5%的硫酸乙醇溶液
方法:使用5 %硫酸乙醇溶液喷板,于100 oC进行加热。
结果:显黑褐色斑点。
显色原理:通过烘烤使样品点碳化显色,故沸点低的或是含碳少的组分不易显色。
(2)碱性高锰酸钾试剂
配制:溶液Ⅰ:1%高锰酸钾溶液;溶液Ⅱ:5%碳酸钠溶液;溶液Ⅰ和溶液Ⅱ等量混合应用。
方法:使用碱性高锰酸钾溶液喷板。
结果:还原性化合物在淡红色背景上显黄色。
显色原理:高锰酸钾分子式为KMnO4,通过与还原性化合物进行氧化还原反应显色,由紫色锰酸根离子还原为粉红色二价锰离子而呈现黄褐色沉淀。
(3)酸性重铬酸钾试剂
方法:使用5%重铬酸钾浓硫酸溶液喷板,于150 oC进行加热。
结果:还原性化合物呈现暗绿色。
显色原理:重铬酸钾分子式为K2Cr2O7,通过与还原性化合物进行氧化还原反应显色,自身由橙红色的重铬酸根离子变为绿色的铬离子。
(4)磷钼酸乙醇溶液:
方法:使用5%磷钼酸乙醇溶液喷板,于120 oC进行加热。
结果:还原性化合物显蓝色。
显色原理:磷钼酸又称为十二钼酸(PMA),是黄绿色化合物,含共轭系统的化合物以及不饱和化合物能将其还原为钼蓝,从而显蓝色,这种蓝色随着组分分子中双键的增加而加深。
3.7.1.2 专用显色剂
由于化合物种类繁多,因此专属性显色剂也是很多的,现将在各类化合物中最常用的显色剂列举如下:
(1)烃类
① 碘粒
检出物:不饱和或芳香族化合物
方法:预先将盛有碘结晶的小杯置于密闭容器内,待容器空间被碘蒸气饱和,将薄层置于容器中。
结果:被检出物呈现棕色斑点。
显色原理:碘显色原理有多种解释,比较常见的解释是碘蒸气分子与化合物络合而显色,另外还有碘溶解于测定的化合物,或与化合物发生加成反应,化合物对碘的吸附作用等。
② 硝酸银/过氧化氢
检出物:卤代烃类。
配制:硝酸银0.1 g溶于水1 mL,加入2-苯氧基乙醇l00 mL,用丙酮稀释至200 mL,再加30%过氧化氢1滴。
方法:喷后置未过滤的紫外光下照射。
结果:斑点呈暗黑色。
显色原理:生成卤化银沉淀,紫外下显示为暗斑。
(2)醇类
① 香草醛/硫酸
检出物:高级醇、酚、甾类及精油。
配制:香草醛1 g溶于硫酸l00 mL。
方法:喷后于120 oC加热至呈色最深。
结果:呈现红、蓝、紫等各色斑点。
显色原理:使羟基脱水,增加双键结构,再经过双键位移,双分子缩合等反应生成共轭双键系统,又在酸的作用下形成阳离子盐而显色。
(3)醛酮类
① 2,4-二硝基苯肼
检出物:醛基、酮基及酮糖。
配制:Ⅰ.0.4%本品的2 mol/L盐酸溶液;Ⅱ.本品0.1 g溶于乙醇l00 mL中,加浓盐酸l mL。
方法:喷溶液Ⅰ或Ⅱ后,立即喷铁氰化钾的2 mol/L盐酸溶液。
结果:饱和酮立即呈蓝色;饱和醛反应慢,呈橄榄绿色;不饱和羰基化合物不显色。
显色原理:2,4-二硝基苯肼通过1位上的肼基进攻待显色组分的羰基,通过加成—消除反应生成2,4-二硝基苯腙,由橘黄色变为红色(通常为芳香族羰基化合物)或黄色(通常为脂肪族羰基化合物)。
(4)有机酸类
① 溴甲酚绿 检出物:有机酸类。
配制:溴甲酚绿0.1 g溶于乙醇500 mL和0.1 mol/L氢氧化钠溶液5 mL。 方法:浸板。
结果:蓝色背景产生黄色斑点。
Br
显色原理:溴甲酚绿
BrOBr
SO3-Br
OHBr
-H++H+
在氢氧化钠溶液中形成蓝色的二
价阴离子(1)在pH低于3.8时转化为黄色的一价阴离子(2)。
BrBr
SO3-Br
O-Br
-
BrO
Br
BrSO3-
Br
21
(5)酚类 ① 氯化铁
检出物:酚类、羟酰胺酸。
配制:1%~5%氯化铁的0.5 mol/L盐酸溶液。 结果:酚类呈蓝色、羟酰胺酸呈红色。
显色原理:如与苯酚显色时:苯酚与FeCl3溶液在水中主要发生络合反应生成酚铁盐:FeCl3+6C6H5OH → H3[Fe(C6H5O)6] +3HCl。由于生成的酚铁盐的电离度很大,在水溶液中电离出呈紫色的阴离子[ Fe(C6H5O)6]3- (紫色)。 (6)含氮化合物
① 硫酸高铈铵/硫酸
检出物:生物碱及含碘有机化物。
溶液:硫酸铈1 g混悬于4 mL水中,加三氯乙酸1 g,煮沸,逐滴加入浓硫酸直至混浊消失。
方法:喷后薄层于110 oC加热数分钟。 结果:被检出物呈现紫色斑点。
显色原理:发生氧化还原反应,由黄色的四价铈还原为紫色的三价铈。
(7)胺类
① 对二甲氨基苯甲醛试剂 检出物:胺类化合物
配制:4 g对二甲氨基苯甲醛溶于100 mL 乙醇中,加10 mL浓HCl混匀制成试剂。
方法:使用对二甲氨基苯甲醛试剂喷板,在50 oC下反应20 min。 结果:被检出物呈显黄色斑点。
显色原理:对二甲氨基苯甲醛(DMAB),类似于DNP显色机理,氨基与醛羰基发生了加成—消除反应,生成腙。 (8)氨基酸及肽类
① 茚三酮
检出物:氨基酸、胺与氨基糖类。 溶液:本品0.2 g溶于乙醇l00 mL中。 方法:喷后于110 oC加热。 结果:呈红紫色斑点。
显色原理:当检测一级胺且含有α-氢(1)时,茚三酮2位与胺反应生成锡夫碱(2),之后通过锡夫碱转移反应及水解生成2-氨基茚-1,3-二酮(3),再与一分子茚三酮反应生成锡夫碱,显蓝色或紫色(4)(如图所示);若是二级胺则无法生成锡夫碱,而是生成了铵盐,显橙黄色。
O
OH
+RO
RO
NH2+HO
HO
O
3
4
O
O2
1
O
R
O
R2
O
2+RCHO
O
3.8 根据初始薄层色谱结果修改溶剂体系的选择
如果想让Rf变得更大一些,可使溶剂体系极性更强些;如果想让Rf变小,就应该使溶剂体系的极性减小些。如果在薄板上点样变成了条纹状而不是一个圆
圈状,那么你的样品浓度可能太高了。稀释样品后再进行一次薄板层析,如果还是不能奏效,就应该考虑换一种溶剂体系。
3.9 做好TLC标记,计算每个斑点的Rf值,并且在笔记本中画出图样。
Rf =(斑点中心与原点之间的距离)/(溶剂前沿与原点之间的距离) 注意事项:薄层层析的Rf值受多种因素影响,即使严格按照实验要求做了,结果的重现性仍较差。因此,薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。
3.10 注意事项
(1)TLC所用的硅胶板一定要保存在干燥器里面,或使用前在红外烘箱里干燥一段时间。
(2)在利用TLC跟踪反应时,在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A,每种难挥发的原料各点一个点B,C,D等等,然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点一个混合点X,这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置,把A这个点展开后的各个层份的点与B,C等原料比较,从而判断原料消失没有,点混合点X的目的在于,方便观察,因为有时候,板展开后,各点的位置有些变形,或者由于边缘效应等等,使得判断不易。
(3)利用TLC判断物质的纯度时,往往要和NMR相结合,因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点,并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。但有趣的是,由于NMR可鉴别的纯度也就在95%左右,有时候NMR显示较纯的东西,点板后会发现有几个点。所以,两者要结合使用。
四、结语
薄层色谱法具有操作简单、快速,设备投资小、检测运行成本低等特点,因此其在医药、生物、环境、食品等各领域得到了广泛的应用。
虽然在我国新推出的2010版药典中,降低了薄层色谱分析所占的比例。但是在实际的工作中,薄层色谱法以其快速、简便的优势一直活跃在分析检测的一线,加上电动点样机和薄层扫描仪的出现,加快了点样和检测的速度和质量,使得这一技术在实验生产中起到了至关重要的作用。
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