琼脂糖凝胶电泳实验
20##-11-03 09:43:56   来源：生物秀   评论：0   我要评论

实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】（1） 学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；（2） 掌握使用水平式电泳仪的方法；（3） 学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的…

凝胶加样缓冲液

    使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速 率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应 关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。
选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

 

第二篇：PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳讲义(工艺实验)

 t-PA基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验讲义

一、 实验目的

    1、掌握PCR反应的原理和方法；

    2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA的原理和方法。

二、实验原理

    PCR原理：首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链，然后在低温下与两个引物进行退火。使引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。每经过一次变性，退火，延伸三个步骤为一个循环，通过三个不同温度的重复循环，在经过约30次后，所扩增的特定DNA序列的数量可增至10000000倍，由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使目的DNA物增加一倍。

    变性（denaturation）：双链DNA在92－96℃变性成单链DNA。

    退火（annealing）：引物在45-72℃与模板的互补区域相结合。

    延伸（extension）：在72℃条件下DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’-OH端，DNA链的延伸方向为5’-3’。

    DNA琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中带负电荷，外加电场用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其由荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（EB）染色；在波长254nm紫外光照射下，DNA呈现橙红色荧光。

    琼脂糖凝胶电泳所需 DNA样品量仅为 0.5-0.1μg，溴乙锭检测 DNA，灵敏度很高，10mg或更少的DNA即可检出。

三、实验仪器

    超净工作台、回转式恒温调连摇瓶机、培养箱、冰箱、深冷冰箱（-70℃）、冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温水浴锅、移液器、微波炉。

  四、实验药品

      蛋白陈、酵母粉、氯化钠、琼脂、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、饱和酚、氯化苄、CTAB、臭酚蓝、醋酸钠、DL2000Marker、TaqDNA聚合酶、Pfu酶、Dntp、Tris、HCl、Tris-HCl、葡萄糖、NaOH、乙醇、乙酸钾、冰乙酸、蔗糖、ddH₂O、EB、EDTA、SDS、引物。

五、实验内容

   本实验为综合性实验，主要从以下几方面开展。

1、设计PCR反应系统

  根据 PCR反应系统的组成和要求，设计 20μL或 50μL的反应体系，可以下表1提供的

50μL的PCR反应体系为参考。

                    

                         

表 1 PCR反应体系

2、进行PCR反应

   PCR反应过程学生自行设计，可参考下列提供的PCR反应条件：94℃，5 min（热启动）；94℃，1min（变性）；52℃，1min（退火）72℃1.5min（延伸）；循环30次；72℃，10min；保温湿度；4℃。

3、对PCR反应产物进行水平板琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定

    将PCR反应产物通过水平板球脂糖凝胶电泳进行分离和鉴定，琼脂级凝胶电泳的具体方法如下：

1）根据所需浓度称取一定量的琼脂糖。加入一定量的1×TAE或其它缓冲液，加热使琼脂糖溶解。

2）溶液冷至60℃时，若需要，则加入溴乙锭至终浓度为0.5μg/mL（也可以在电泳之后再进行染色。）。

3）琼脂糖倒入制胶模具，凝胶厚度一般为0.3-0.5cm。迅速在模具一端插上梳子，检查有无气泡。

4）室温下放置30-45min后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子将凝胶放置于电泳槽中。

5）加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面高于胶面1mm，凝胶两端的电压与外加电压相等。

6）在DNA样品中加入1／6的上样缓冲液，混匀后，离心聚集液体，使溶液全部汇集于管底部，用移液枪将加样混和液加入样品孔中。

7）接通电泳槽与电泳仪的电源，电压降选择l～5V／cm。

8）根据指示剂迁移的位置来断定是否终止电泳，切断电源后再取出凝胶，未加EB的凝胶需要在含有 EB的缓冲液中浸泡约 20～25min。

9）取凝胶在凝胶成像系统中检测电泳结果。

   t-PA是组织型纤溶酶原激活剂，由527个氨基酸组成。t-PA cDNA大小约1．6kb。

六、实验结果的讨论

1、PCR反应的原理是什么？影响PCR反应的主要因素是什么？

2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么？如何选择琼脂糖凝胶的浓度？EB的作用是什么？