PCR反应及琼脂糖电泳实验报告

多聚酶链式反应(PCR)扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测

一、实验目的:

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

二、实验原理:

PCR是一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增DNA片段的技术,这一技术需要模板、四种脱氧核苷酸等组分条件外,还需要不同温度环境以进行DNA的解旋和聚

1、PCR反应组分

细胞内DNA复制条件分析:

此外,试验中用到的还有Mgcl2,Mg2+能激活酶的活性;10* Buffer 缓冲液,为Taq酶提供合适的PH条件。

2、PCR反应条件

PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合,现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。

PCR一般经历三十多次循环,每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。

(!)变性(模板DNA解旋)

模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后,使模板DNA双链解离,使成为单链,以便于它与引物结合,为下轮反应作准备。

(2)复性(退火)

模板DNA经加热变性成单链后,温度降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

(3)延伸

DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料,以母链为模板,按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理,合成一条新的DNA链。

3、PCR产物的检测

(1)紫外分光光度计

DNA在260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰,可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出DNA的含量。

(2)琼脂糖凝胶电泳

DNA在电厂作用下,可以由电源的负极向正极泳动,泳动的速度与DNA片段的长度成负相关,与电压强度成正比,因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker(不同已知碱基对大小的DNA片段的混合物)的条件下,由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同,因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的条带做比较,可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小,可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合,一起电泳,DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源,荧光染料在该光照射下可见到荧光,荧光的亮度与DNA大小成正比。

三、实验仪器及试剂

7种PCR组分 微量可调移液器 离心管 PCR仪 水平电泳槽 电泳仪电源 紫外分光光度计 250ml锥形瓶(封口膜) 记号笔 卫生纸

四、实验步骤

1、DNA体外扩增

(1) 将所有试剂管瞬时离心一次(4000r/min,1min),使管壁没有残留药品,在引物I 和引物II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水(ddH2O),混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。

(2)向装有Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分:

原有的Taq DNA 聚合酶有15ul,此时混合液体系共计500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。(在实验老师的监督指导下操作,确保此后其他同学的实验顺利进行)

(3)共分25组,第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于0.5ml的离心管中,加入15ul的液体石蜡封闭体系,以防止在加热过程中蒸发。

(4) 对自己组的离心管上进行标记之后,放到PCR仪上进行DNA扩增。

2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA

(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净,放在水平桌面上,并架好梳子。

(2)配制浓度为1%(1 g/100 mL)的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中,称取1g的琼脂糖粉,加入100ml 1x电泳缓冲液,用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热,使琼脂糖粉熔化,然后冷却至60 ℃,倒入电泳槽中(每块胶50ml),插好梳子,待其凝固。(电泳槽首先用透明胶带将两端封住再进行倒胶)

(3)待胶凝固后,去掉胶带纸,小心移去梳子,注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至于水平电泳槽内,梳井(点样孔)一端朝负极方向。向电泳槽中缓缓倒入1x电泳缓冲液,以没过胶面2 mm为宜。

(5)将80ul的6xLoading Buffer 加入到80ul的核酸荧光染料中,按1:1比例混合。

(6)移液器枪头插入到扩增出的样品离心管的底部,吸取20ul样品于另一0.5ml的离心管中,注意不要吸到液体石蜡,再加1ul的染料混合液,充分振荡混匀。用移液器吸取10ul缓慢加入梳井内,枪头抵到梳井口,以防止样液被缓冲液冲散,此外,为防止手抖将凝胶破坏,可以用左手扶住右手的手腕。

(6)盖上电泳槽盖,接通电源,电压为80 V,电流最大。

(7)当指示剂移动到凝胶中间时,断开电源,终止电泳。

(8)取出凝胶块,在DNA图谱观察仪中观察电泳带及其位置,判断扩增产物的情况。

3、紫外分光光度计检测DNA含量

(1)最后1组取2ulPCR反应液,加入98ul蒸馏水,将样品稀释50倍。

(2)以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零。

(3)加入DNA稀释液100ul至比色杯中,测定260nm处的光吸收值。

(4)根据下面的公式计算DNA含量:

DNA含量(ul/ml)=50*(260nm的读数)x稀释倍数

       五、注意事项

    1 离心机上盖没有锁,在离心机运转时,转速最高可达16000r/min,如果这时打开离心机上盖,里面的离心管就会甩出,对人身造成危险,切忌等全部停下来之后再打开上盖取出离心管。另外,离心管一定要对称放置。

    2 水平电泳槽在电泳时一定要盖上上盖,此时的缓冲液电压可以达到80V,大大超过了人体的安全电压,切忌不能用手触碰缓冲液或者是电源两端接头。

                                     

 

第二篇:质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

一、实验名称:质粒DNA的提取与纯化,DNA琼脂糖凝胶电泳

二、实验原理:

1.质粒DNA的提取:

质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外(细胞质中)呈游离状态的双链、闭环的DNA分子,能够自主复制和稳定遗传,以超螺旋形式存在,是最常用的基因克隆载体。除质粒外,大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质,因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法,即利用SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。

(1)碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理:

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA,达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下,线性的DNA因氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕,不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA复性,恢复其天然构象,以可溶状态存在于液相中;而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质,然后用无水乙醇沉淀,即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。

(2)四种溶液作用及原理:

①Solution I的作用:悬浮大肠杆菌菌体,增加溶液的粘度,维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,在溶液I中加入EDTA,是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉,从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。

②Solution II的作用:提供碱性条件,pH高达12.6,使大肠杆菌瞬间裂解,促使染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠(SDS)可使细胞膜、核膜发生破裂,充分溶解膜蛋白。同时,磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。

③Solution III的作用:为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾,从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀,与质粒分离开来;另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性,使pH降至中性,因为长时间的碱性条件会打断DNA;基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100kb大小的片段,就没有办法再被PDS共沉淀,这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA的提取过程中,沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低,较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA

④无水乙醇的作用:是实验中最常用的沉淀DNA的方法。DNA 溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混 合,其乙醇的最终含量占67%左右。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。 也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

2.质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳:

利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时的电荷效应和分子筛效应而达到分离、鉴定DNA的目的。DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷,在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的构型和大小。不同的分子因为所带电荷、分子质量或者构型的不同,在同一电泳系统中的泳动速度不同,因而可以彼此分离,并检测起分子量大小。未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带,之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光染料如溴化乙锭(EB)染色直接观察到,甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到,从而对DNA进行定性或定量的测定。

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