柱离心法小量提取质粒DNA及DNA的琼脂糖凝胶电泳
实验目的和要求:
1、了解质粒DNA的应用,并学习用柱离心法小量提取质粒DNA。
2、掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的方法。
实验原理:
质粒是细菌中独立于染色体之外的较小的环状双链DNA,它通常携带某种药物(如氨苄青霉素,卡那霉素,链霉素,四环素等)的抗性基因,具有独立的复制原点,并且具有较高的拷贝数(从几个到几百个不等)。
柱离心法首先用碱使大肠杆菌裂解,并使其中的DNA(包括质粒及细菌的染色体DNA)全部变性。再用酸性缓冲液中和,质粒DNA由于分子较小,很快复性,而染色体DNA分子巨大,几乎不能复性,最后和细胞碎片及膜蛋白共沉淀被离心去除,上清液中含有复性的质粒DNA,蛋白质,RNA,并且盐浓度较高。在这种条件下,质粒DNA能够牢固地结合在离心柱中的吸附基质上,而大多数蛋白质和RNA在离心时被穿过,残留在吸附基质上的少量蛋白质和RNA可以用漂洗液洗去,最后,吸附在离心柱上的质粒DNA用低离子强度的溶液或水洗脱。
与蛋白质相比,DNA的分子量通常要大得多,必须用孔径较大的琼脂糖凝胶介质进行分离。
在理想的电泳条件下,具有相同构型的DNA的电泳迁移率和它们分子量的对数成线性关系,分子量相同的质粒DNA的电泳迁移率和它们的构型有关,由快到慢通常为超螺旋,线性,开环和复制中间体(连环体)。
DNA限制性内切酶可以从内部切割环状或线状双链DNA,II型DNA限制性内切酶具有固定的识别位点和切割位点,它们可以在特定位点以特定方式切割质粒DNA,并且产生有固定序列及形状的末端。因此,它们在重组DNA技术中具有重要作用。
实验材料:
含质粒的大肠杆菌DH5α; LB+Amp培养基(配方参照《分子克隆》,除非特别说明,以下同);柱离心质粒小量制备试剂盒(博大泰克公司);质粒DNA(pUC18-G);电泳用琼脂糖;TAE缓冲液;goldview荧光染料;6× DNA上样buffer;限制性内切酶EcoRI (10 U/μl,G’AATTC);HindIII (10 U/μl,A’AGCTT);10× buffer R。
实验方法:
1.将带有质粒的大肠杆菌单克隆接种到1.5 ml含有相应抗生素的液体培养基,37℃振荡培养12~16小时;
2. 1.5 ml过夜菌转移至Eppendorf管中,10000 rpm( r/min)离心1 min,用水泵吸干培养基上清液,加入100 ml 溶液I(含RNaseA),充分混匀;
3.加入150 ml 溶液II,加盖颠倒6-7次使之混匀,室温放置1~2min;
4.加入150 m l 溶液III,加盖后颠倒6-7次混匀,室温放置5min;
5.用台式高速离心机,12000 rpm离心10min;
6.吸附柱中加入420 μl 结合缓冲液,将步骤5中的上清转移至吸附柱中,盖上收集管的盖子,混匀, 12000 rpm离心1 min;
7.取下吸附柱,倒掉收集管中的液体,吸附柱放回同一收集管,向吸附柱中加入600 μl 漂洗液 , 静置1 min,12000 rpm离心30 s;
8.重复步骤7一次;
9.取下吸附柱,倒掉收集管中的液体,吸附柱放回同一收集管, 12000 rpm离心2 min;
10.吸附柱放入一个新的1.5 ml离心管,在吸附柱的中央加50 μl洗脱缓冲液或 TE buffer或水,室温放置3 ~ 5分钟。盖好盖子12000 rpm 离心1分钟,收集质粒DNA溶液,-20℃冻存备用;
11.在250 ml椎形瓶中称取0.6 g琼脂糖,加60 ml 1× TAE buffer,在微波炉中加热至沸腾且均匀;
12.往胶溶液中加3 μl goldview荧光染料,混匀,室温自然冷却;
13.制胶板两头分别用胶布封好,放置在水平的实验台上,将梳齿架在制胶板的梳齿槽内,待胶溶液冷至~50℃时,把60 ml胶液全部到入制胶板中,室温自然冷却至充分凝固;
14.撕去封制胶板的胶布,将装有凝胶和梳齿的制胶板放入电泳槽中,加1× TAE至高过凝胶表面加样孔顶端~2 mm,小心拔出梳齿;
15.取5 μl质粒DNA,与1 μl 6× DNA上样buffer混匀后全部加入点样孔,100 V恒压电泳至溴酚蓝指示剂前沿走到凝胶中间(约需1小时);
16.关闭电泳仪,连制胶板一起取出凝胶,在凝胶成像系统中观察电泳结果并拍照;
实验结果:
实验现象讨论:
1、分析影响琼脂糖电泳迁移率的主要因素:
(1)DNA的分子量:质粒DNA是不同于染色体DNA的一种分子量较小的DNA,因而迁移率较小;
(2)琼脂糖浓度:
上网查得:分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度见下表:
(2)DNA的分子构型:
质粒DNA为环状双链DNA,由实验原理:可知分子量相同的质粒DNA的电泳迁移率和它们的构型有关,质粒DNA的电泳迁移率较小
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