《免疫学基础及实验技术》

实验报告

姓名: 姚丽君

专业：针灸推拿学

年级：20##年研究生

实验室：免疫试验室

时间：20##年1月12日

教师：李永念老师

免疫学教研室

人血清I的提取及鉴定

一．             主要原理：

（一）   离子交换层析提取人血清I gG：离子交换剂采用DEAE-纤维素，是表面交联有二乙基乙胺基团的纤维素，本身带有真电荷，能吸附阴离子。DEAE-纤维素悬浮在PH高于6.5，克分子浓度低的缓冲液内，置备成层析柱。人血清经过PH7.4磷酸缓冲液透析平衡后，其中的IgG不带电荷或仅带少量电荷，其他的蛋白质则主要带负电荷，这样的血清样品通过相同缓冲液平衡好的DEAE-纤维素柱，除IgG以外的血清蛋白都吸附在柱上，仅IgG最易形成吸附-解离-再吸附-再解离的状态，因此能随洗脱液一起最早从柱中流出，收集洗脱液获得IgG。

（二）   血清I鉴定：以收集的洗脱液为抗原，与兔抗人IgG做琼脂双扩散实验，可根据沉淀线的形成确定IgG抗原性。用免疫电泳法使血清中各种蛋白的分子大小以及电荷状态、电荷量均有差异，因而它们的泳动速率也不相同，根据在凹槽中加入免抗人血清，上下两孔加入用蔗糖包埋法进行浓缩后的浓缩液和正常人血清，经一段时间后出现沉淀弧，根据沉淀弧的情况来检测所获的IgG的纯度。用754型分光光度计于280nm紫外光源测定洗脱液光密度值，根据IgG的E1cm1%=14.3(OD)公式，可计算出收获的IgG含量，并推算出所获得IgG的百分率。

二．主要材料：

1．           0.5N NaOH、0.5N HCL 、0.85%NaCL按常规配制

2．           DEAE-纤维素   健康人全血

3．           PH7.4  0.01M磷酸缓冲液

4．           20%三氯醋酸水溶液按W/V比例配制

5．           蔗糖（研成细粉状）

6．           PH8.6  0.025MBA巴比妥纳-巴比妥缓冲液，2M NaCL水溶液

7．           1.5%琼脂凝胶

8．           布氏漏斗、抽滤瓶、水泵、试管，烧杯，玻璃棒，滤纸试纸、蝴蝶铁架、透析袋、离心机，746-电泳仪、754型分光光度计

三、操作步骤：

（一）DEAE-纤维素预处理：

1、    称取DEAE-纤维素1２克，均匀撒在事先盛有150ml 0.5NNaOH的烧杯中，人其自由沉降，放置４０－５０分钟，不时地用玻璃棒轻轻搅动。

2、    将湖状物移入垫有滤纸的布氏漏斗中，连接漏斗抽滤瓶，并用水泵抽干糊状物。立即将DEAE-纤维素移入烧杯中，加蒸馏水，浸泡20-30min并不时搅拌，再移入漏斗抽干，如此重复，至洗出的PH值等于8即可。

3、    将交换剂移入150ml 0.5N HCL中放置40-50min，不时轻轻搅动，移入布氏漏斗抽滤，再依同法用0.5N NaOH处理一次，时间不超过50min。

4、    重第2项操作，至抽滤液PH值等于8即可，最后PH7.4 0.01MPB液浸泡交换剂，抽干，再重复一次，然后将交换剂用相同PB调成糊状，保留至装柱。

（二）   装柱、平衡

1、    固定层析柱在蝴蝶铁架上，垂直。柱上方放置PH7.4 0.01MPB液的洗脱瓶，以乳胶管相连，柱底部有细胶管，装止水夹，调节流速。

2、    将上糊状物倾入柱中，打开柱底流出口，用烧杯接流出液，注意不能断层，纤维素中不允许进空气，柱上表面要平，上部要留有约3cm高空间。

（三）   上样和洗脱

1、    将人血置离心机以2000rpm，10min离心，取出并用毛细吸管吸取10 ml人血清装入透析袋，于烧杯内浸入40倍于血清体积的起始缓冲液中，置4℃冰箱内透析过夜，中途更换两次缓冲液;

2、    打开柱上端塞子，用带有橡皮乳头的毛细吸管吸出交换剂表面的缓冲液，至仍2mm厚的液面，以免空气进入;

3、    用清洁细吸管将已平衡好的血清样本原柱管内壁缓缓加在纤维素柱表面，调节流速，使样品进入交换柱内，约3ml/10min;

4、    待液面还约2mm厚的样品时，用少量起始PB冲洗柱内壁，到PB进入交换剂仍留有2mm后液面时，再冲洗二次，保持柱面平整;

5、    最后加适量起始缓冲液，连接洗脱瓶，流速调至30-40ml/cm²/h ;

6、    收集洗脱液与试管中，每管5ml，共收集12管。并从各管中取1-2滴，加20%三氯醋酸1-2滴检测。

（四）   洗脱液抗原性鉴定

1、    用1.5%琼脂凝胶制版，根据下图用打孔器打孔：

2、    加样：中心孔加入兔抗人IgG，从收集的12管洗脱液中用毛细吸管吸取洗脱液分别加入周围六孔，每孔所加样品的量以液面与孔测平齐为准；

3、    将琼脂板置湿盒内37℃温箱孵育24小时，观察结果。

（五）    IgG纯度鉴定

1、    琼脂板制作：用1. 5%琼脂凝胶加热融化后倾注在载玻片上，玻片上放一条细玻棒，等凝胶凝固后在玻棒上下两侧打孔，制成如图所示：

2、    洗脱液的处理：将通过离子交换层析法收集的12管洗脱液，用754型分光光度计测各管洗脱液在波长280nm的光密度值，第一个蛋白峰为IgG，收集有IgG活性的三管洗脱液，混合后装于透析袋内，用蔗糖粉末将其包埋使其浓缩；

3、    加样：如图示上孔加入浓缩的IgG提取液，下孔加入正常人血清，将加样后的琼脂板置于746-电泳仪上，用四层纱布条做桥，连接凝胶板与电极缓冲液。该桥搭在凝胶上部分约5mm，尽量拉直，与胶面间不能有气泡；

4、    连接电源，调节指示电压至100V（端压约为5V/cm），电泳槽加盖后，电泳至血清蛋白迁移至距正极段边缘1cm处，关闭电源；

5、    凝胶板与桌面，取出玻条，凝胶中部既成一长槽，加兔抗人全血清加入槽内与胶面水平；

6、    置凝胶板与湿盒内，于37℃或室温中孵育，12小时观察沉淀弧出现的情况。

7、 计算回收率：取透析袋内浓缩的提取液，用754型分光光度计测波长280的光密度值，如果超出测定范围，稀释后再测，按浓缩后IgG(mg/ml)=OD₂₈₀×1.43×回收体积，正常人血清IgG:12(mg/ml) ×收集的血清体积，回收率=浓缩IgG/正常人血清IgG，计算回收率。

四、实验结果：

1、DEAE-纤维素洗脱，收集洗脱液12管，均为略带黄色的液体，取样添加20%三氯醋酸，各管中仅第4、5管出现浑浊，表明试管洗脱液中含蛋白质。其余管未见明显反应。

2、  745型分光光度计测出12管洗脱液的光密度（OD）值如下：

做A₂₈₀光密度值峰值曲线图如下：

                                                        （试管数）

a)         经过蔗糖粉末包埋后，收集到浓缩的IgG为3.5ml，测其OD值为3.52，此值已经超出光密度计测定范围，取0。5ml浓缩液加2.5ml生理盐水稀释5倍后测OD值为2.52。

b)        按下列方法计算IgG回收率：

浓缩后IgG：C(mg/ml)=OD₂₈₀×1.43×体积（3. 5×5）

正常人血清IgG：12(mg/ml) × 体积(8ml)

回收率=浓缩IgG/正常人血清IgG

=2.52×1.43×3.5×5/12×8

=65.69%

3、  向琼脂扩散试验结果如下图，有白色成沉淀线出现，彼此相互融合相连。

4、  疫电泳（纯度鉴定）如下图，有沉淀弧出现，提取液与抗人全血清之间只出现一条沉淀弧，并靠近凝胶板负极端，说明所提取IgG为纯品。人血清与抗人血清之间由于存在多抗原抗体成分，所以出现多条沉淀弧。

五、分析与讨论：

IgG是一种具有抗体活性的免疫球蛋白，其具有一般蛋白质的通性，是再次体液免疫应答产生的主要Ig。IgG主要由脾脏和淋巴结中浆细胞合成，含量高（在血清中含量最高），分布广，它能与抗原特异性结合，从而在体内介导多种生理和病理效应。

本次试验是利用离子交换剂的特性，血清中IgG不带电荷或仅带少量电荷，其它的蛋白质则主要带负电荷，使人血清通过带阳离子DEAE-纤维素制成的交换剂，带负电荷的蛋白质与阳离子交换剂结合，而不带电荷的IgG处于游离状态，用PH7.4的磷酸缓冲液通过层析柱，未结合的IgG随洗脱液 一起流出，试管收集，这样使血清样品通过DEAE-纤维柱而得以分离出IgG。收集的洗脱液颜色略带黄色，可能是收集血清时吸入了破碎的红细胞。在加入三氯醋酸后4、5管出现沉淀，说明从第4管开始有大量的IgG存在，IgG峰值集中在3、4、5三管，并峰值上升和下降很快，未见馒头峰，证明洗脱较好。

本次试验已成功地收集了IgG。从双向琼脂扩散试验的结果看，中间孔抗人IgG与周围孔的提取液IgG之间的凝胶出现一条白色沉淀线，3、4、5孔之间形成的沉淀线相互吻合，这说明IgG与抗体抗人IgG浓度相当，提取液为单一抗原，即IgG。通过免疫电泳结果看：在滴加浓缩提取液的一测出现一条沉淀弧，说明浓缩提取液中只有一种抗原物质，而在滴加正常人血清的一测出现多条沉淀弧，说明正常人血清中存在多种抗原物质。所以，通过以上两个试验证明：经分离提取的为纯IgG。

根据回收率看本实验的提取及回收比较有效，亦可根据公式计算IgG的浓度为18.018mg/ml。

实验七    抗体形成细胞的检测

一、脾细胞介导的羊红细胞分光光度计定量测定法（QHS）

二、主要原理

将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞在试管内混合，加入适量补体，在水浴中孵育一定时间，在补体的参与下，引起抗体形成细胞周围的绵羊红细胞溶解，而且溶血的程度与脾细胞中的抗体形成细胞总数有一定的关系，与抗体形成细胞所分泌的抗体量有关，但不能反映单个抗体分泌细胞的数量。因抗体形成细胞上有抗绵羊红细胞抗体，与绵羊红细胞结合，在补体的激活下，绵羊红细胞溶解，故抗SRBC抗体又称溶血素。通过一定量SRBC完全溶解的最高血清稀释度得到溶血素的效价。QHS法可用于检测药物对SRBC诱导抗体产生过程是否有刺激作用和抑制作用。

三、主要材料

1、  SRBC保存液，预先洗三次，配置为0.5%、1%浓度的SRBC

2、  Balb/c小鼠（体重25左右，雌雄随机），免疫与未免疫小鼠各6只

3、  0.01M PH7.2 PBS（含Ca²⁺，Mg²⁺），生理盐水

4、  补体（预先制备好的，需稀释成1：30），荧光标记的免疫小鼠IgG

5、  其他：水浴箱、离心机、试管、玻片、毛细吸管、组织研磨器等

四、操作步骤

1、先摘除免疫小鼠的眼球，收集血液于清洁干燥试管内，待血液凝固后，置恒温箱37℃内30min，血清析出，并收集与小管保存，以备测溶血素；

2、颈椎脱臼处死小鼠，暴露腹腔，用PBS清洗，用组织研磨器研磨置备单细胞悬浮液（每个脾脏加5mlNS），然后离心（2000转/分）10min，弃上清夜，再加生理盐水离心，如此重复3次，各管最后留下的沉淀分别加生理盐水至8ml备用；

3、取6个试管，设1、2、5号为免疫后的小鼠，3号为未免疫小鼠，4、6号不装入脾细胞，然后按如下操作，混匀，置37℃水浴箱30min，目测结果如下：

                                                                    单位（ml）

4、溶血素效价的测定：

1) 取前血清制备测血清，离心；

2)      取前制备免疫小鼠，取0.1ml于第一试管中，再加入0.9NS 1ml，混匀从中取0.5ml加入第二个试管中，再加0.5mlNS，混匀，取0.5ml加入第三管中，继续如此加至第9管，稀释后取出0.5ml丢弃，最后一管只加NS，然后再于各管中加入0.5ml补体（1:30）和0.5ml 1%SRBC，摇匀，于37℃水浴30min，取出后看结果。方法与结果如下：

注：完全溶血用“+”，完全不溶血“-”

3)      依同样方法做未免疫小鼠各10管，其结果为完全不溶血，液体混浊。

五、讨论与分析

脾细胞介导的绵羊红细胞分光光度计定量测定法运用了细胞溶血反应来检测溶血的程度与抗体形成细胞总数及所分泌抗体量的关系。抗原和抗体结合形成抗原-抗体复合物，抗体铰链区构型改变，使Fc段的补体结合部位暴露，补体C1与之结合，通过经典途径激活补体系统，形成攻膜复合体，并在细胞膜上形成小孔，使小的可溶分子、离子以及水分可以自由通过胞膜，蛋白质却难以从胞浆中逸出，最终水和离子内流，胞浆渗透压降低，细胞溶解。所以要达到溶细胞作用，必须有抗原、抗体和补体的存在，浆细胞上的抗绵羊红细胞抗体是经SRBC免疫的小鼠脾脏产生的，需与SRBC混合后，有补体存在时，在一定条件下，SRBC才被破坏产生溶血反应，可见试管中液体呈清亮，而未免疫鼠或无补体存在的情况下，都不能产生溶血，试管中液体成混浊。但此不能反映单个抗体分泌细胞的数量。

抗SRBC抗体又称溶血素，通过稀释结果可知溶血素的效价。本次实验所测最高稀释效价为1：2560，实验组所做结果不同，说明每只鼠的个体差异。

 

第二篇：免疫试验设计

  免疫学实验设计

    

题目：StreamlineDireetHST分离卵黄抗体

班级：20##级临床医学本科（12）班

姓名： 

StreamlineDireetHST分离卵黄抗体

班级：20##级临床医学本科（12）班

作者及学号:

一、实验背景

1、卵黄抗体即卵黄免疫球蛋白（Egg Yolk Immunoglobulin，lgY），目前研究较多的是鸡卵黄抗体。母鸡接受免疫后，在卵黄成熟期，血液中的免疫球蛋白IgG选择性的转移到卵黄中形成IgY。IgY是一种7S免疫球蛋白，分子量180kD，由两条重链（分子量22~30kD）组成，等电点接近5.2。IgY的结构虽与IgG相似，但其Fc段氨基酸组成与IgG相差很大，不结合类风湿因子，不与蛋白A、G以及哺乳动物Fc受体和补体结合。在免疫检测中，可代替哺乳动物来源的抗体，提高监测的特异性及敏感性。已经证明特异性IgY对人及动物的许多疾病具有一定的预防和治疗作用，与其他用于被动治疗的免疫球蛋白相比，IgY具有价廉易得、稳定性好、可口服等优点，在疾病的免疫检测和防治方面具有良好的前景。

IgY具有以下优点:

（1）    由于鸡与哺乳动物的种系关系较远,可产生针对哺乳动物保守蛋白的抗体(在哺乳动物体内难以产生),用于免疫学测定“同时IgY不与类风湿因子(RF)及哺乳动物补体结合,减少了免疫检测的干扰,提高准确性”。

（2）    经特定抗原免疫后,母鸡产生对抗原的持久性应答,可不断获得特异性的多克隆抗体,其均来源于同一个体,抗体均一性好。

（3）卵黄中的IgY含量明显高于鸡血清中lgG的含量,约为巧一25mg/mL卵黄在相同的免疫时间内,由一只鸡所生鸡蛋中提取的抗体量是由一只兔的血清制备的120倍。

（4）    IgY还可抵抗幼龄动物的胃酸屏障作用,并可抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。

鸡蛋提供了廉价易得的IgY来源，从一枚鸡蛋中可获得100~250 mg IgY。如何将大量的卵黄抗体提取出来，是决定IgY能否被广泛应用的一个重要前提。鸡卵黄中含水48%、蛋白质17.8%、脂肪30.5%，其中几乎所有的脂肪都与蛋白质结合形成脂蛋白，IgY是水溶性的蛋白。从卵黄中获得卵黄抗体的过程包括IgY分离、提取和纯化高含量的脂肪及脂蛋白。

2、StreamlineDireetHST是一种新型吸附剂，主要为阳离子离子交换吸附，同时伴有疏水作用，可以用来处理高粘度的料液。

已有实验成功实现了StreamlineDireetHST对模型蛋白的静态吸附。以牛血清白蛋白(BSA)和牛血红蛋白为模型蛋白，考察了pH和盐浓度对streamlineDireetHsT吸附蛋白质的影响。结果表明,streamlineDireetHsT对蛋白质的吸附随pH的变化而变化，存在最适pH使得吸附容量最大，蛋白质分子体积的变化在一定程度上会影响吸附容量。当蛋白质与吸附剂存在静电吸引作用时，吸附过程由静电相互作用主导，吸附等温线符合Langmuir吸附方程；当存在静电排斥作用时,吸附等温线则呈现典型的多分子层吸附模式。

StreamlineDirectHST吸附剂的吸附容量大，可以在很高的料液流速下高效吸附蛋白质。料液的盐浓度对于吸附没有大的影响，对于高粘度料液不需稀释可以直接进样，所以料液可以省去很多处理步骤，节约成本，可以采用提高离子强度或是改变pH来洗脱蛋白质。

既然IgY是一种蛋白质，因此，可以设计一个StreamlineDireetHST分离卵黄抗体IgY。

二、实验原理

阳离子交换型混合模式吸附剂streamlineDirectHST对蛋白质的吸附受pH和盐浓度的共同影响。streamlineDirectHsT对蛋白质的吸附随pH的变化而变化，存在最适pH使得吸附容量最大，蛋白质分子体积的变化在一定程度上会影响吸附容量。当蛋白质与吸附剂存在静电吸引作用时，吸附等温线符合Langmuir吸附方程；当存在静电排斥作用时，吸附等温线则呈现典型的多分子层吸附模式。

卵黄抗体在pH4一9之间性质较稳定，所以本实验采用pH4一9的缓冲液进行层析分离。

三、实验目的

1、了解streamlineDirectHST分离蛋白的原理。

2、探索streamlineDirectHST对卵黄抗体分离的可行性。

四、材料与方法

1、            试剂与仪器

试剂：StreamlineDireetHST吸附剂，磷酸氢钠和磷酸二氢钠。

仪器：AKTA explorer 100层析系统，Ultrospec 3300 pro 分光光度计，台式PH/ISH测试仪。

2、            方法

（1）    卵黄水溶性组分(WSF)的提取

采用水稀释法除去卵黄中的大部分脂类。具体方法如下：取购自农贸市场的新鲜鸡蛋一只，打一小孔将蛋清倒出，将孔扩大并用蒸馏水冲洗卵黄1一2次。将卵黄倒至滤纸上吸干水分，刺破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄用蒸馏水稀释六倍，并用0.1M的HCI溶液调节pH至5.2，放入4摄氏度冰箱静置过夜。将卵黄溶液800Orpm离心30分钟，上清液中含有卵黄水溶性组分(包括卵黄抗体)，沉淀弃去。

（2）    StreamlineDireetHST分离IgY

取预处理好的卵黄稀释液的上清液，用0.2um滤膜过滤，作为进样样品，每次进样量为2ml。层析柱(内径1cm)中填充5ml Streamline Direct HST。使用AKTA explorer 100蛋白质分离纯化系统进行层析分离实验，改变平衡液与洗脱液的pH和盐浓度进行层析分离，收集各流出组分，并作lgy电泳分析。

（3）    SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳分离

配制30%凝胶贮液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、1%TEMED、10%AP、电极缓冲液与2ｘ非还原态染色液。

制板：采用8%的分离胶和3%的浓缩胶。取待电泳的样品，与等体积的2ｘ非还原态染色液混合。上样前沸水浴中3一5分钟。层析料液样品上样量为5ul,穿透液与洗脱液样品上样量为15ul。

五、实验预期结果与讨论

1、实验结果

StreamlineDireetHST成功分离了卵黄抗体

2、讨论

streamlineDireetHsT是阳离子交换型混合模式吸附剂，而卵黄抗体在pH5.0左右呈中性，净电荷为零。理论上分析，选择上样平衡液pH应该小于7.0，使IgY带正电荷，而与吸附剂产生静电吸附作用。根据此技术在蛋白质分离中的经验，在pH<4时，streamlineDirectHsT的梭基基团将渐渐趋于不解离，对蛋白质的吸附容量会减少，同时考虑到IgY在pH<3时活性将急剧降低因此选择上样平衡液的pH在4.0一6.0之间。

洗脱时改变缓冲液的pH使蛋白质带负电荷与吸附剂产生静电排斥作用。IgY等电点接近7，因此使用中性或碱性缓冲液使卵黄抗体带负电荷，与streamhneDirectHsT发生静电排斥，洗脱蛋白。IgY在pH>ll时活性开始下降,因此为保持较高的蛋白质活性，实验中洗脱液均使用pH7一10的缓冲液。

六、参考文献

1、《混合模式层析及其用于抗体分离纯化的研究》浙江大学 何瑜芳

2、《卵黄抗体对肠道感染小鼠粘膜的调节作用》大连理工大学 宗颖

3、《家禽卵黄抗体作用机理及应用现状分析》 燕海峰；邓源；朱立军；肖兵南

4、《单个B细胞抗体制备及应用》 生物工程学报 迟向阳；于长明；陈薇