天然药物化学实验

实验须知

天然药物化学实验教学是天然药物化学课程的重要组成部分，是更好掌握中草药有效成分提取、分离和检验的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力，使同学进一步理论联系实际，养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节，为此，提出如下实验须如：

1．遵守实验室制度，维护实验室安全。不违章操作、严防爆炸、着火、中毒、触电、漏电等事故的发生。若发生事故应立即报告指导教师。

2．实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，安排好当天计划，争取准时结束，实验过程应养成及时记录的习惯，凡是观察到的现象和结果以及有关的重量、体积、温度或其它数据，应立即如实记录。实验完毕后认真总结，写好报告，提取纯化所得单体产物包好，贴上标签（写下日期、样品名称、纯度、m.p.、b.p.、TLC、重量）交给老师。

3．实验室中保持安静，不许大声喧嚷，不许抽烟，不迟到不随便离开，实验台面保持清洁，使用过的仪器及时清洗干净后，存放实验柜内。废弃的固体和滤纸等丢人废物缸内，绝不能丢入水槽和窗外，以免堵塞和影响环境卫生。

4．公用仪器及药品用完后立即归还原处，破损仪器应填写破损报告单、注明原因。节约用水、用电、节约试剂，严格药品用量。

5．保持实验室内整洁，每次实验完毕，值日学生负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净、倒清废物缸，检查水、电（是否关闭水龙头、拉下总电闸，拔下电插头）。关闭门窗。

天然药化实验中常用方法

植物是人类防病治病的一个重要来源。提取、分离植物中具有生理活性的化学成分，是天然药物化学研究的一个重要课题。

植物体内所含的化学成分明是有机化合物的混合物。一般分类为挥发性、非挥发性、碱性、酸性、中性等化学成分。

从植物体内提取并分离得到天然化合物的一般方法。首先将原药材研成均匀细粒（20目），然后用溶液或混合溶剂渗漉（或萃取）。所用溶剂应能溶解所需的物质。如含挥发性物质（常有特殊的嗅味，如桔皮的挥发油呈芳香气味）。大多数天然产物是难挥发的，所以将提取物除去溶剂后，得到的是油状或胶状的物质（如药材的乙醇提取物多数为棕黑色浸膏），需要进一步处理以使粗提取物分成各种组份，少数天然产物的纯品为结晶形化合物，在提取液中除去部分溶剂后结晶形沉淀即从溶液中析出。

通常药材的提取物可用酸或碱处理，使碱性或酸性组份从中性物质中分出。挥发性的化合物则可将残留液用水蒸汽蒸馏使其与非挥发性物质分开。

通常用溶剂法将药材中各类天然化合物先分开为几个组份。

进一步的分离方法有结晶法、沉淀法、分馏法。随着近年来物理学、化学和电子技术的飞跃发展，出现了多种分离技术，其中色谱技术在分离、纯化植物化学成分方面效果更好。

测定所分离天然产物的结构，经典的方法，如官能团的定性试验，未知物化学降解成已知物质，制备衍生物、沟通化合物的结构、化学反应，各类天然化学成分的定性试验，溶解度试验，熔点测定等。进年来，质谱红外、紫外和核磁共振等波谱方法，单晶X—衍射方法等应用，使结构测定在速度、准确度上大大地提高。

具有药用的天然产物，由于自然界资源供应十分有限，所以天然产物的合成是一个重要的方向。天然药物合成课中将论述。

本实验课主要是学习天然药物的提取、分离、纯化、鉴定的方法。使学生通过实验能为今后从事天然药物活性成分研究和天然药物生产艺研究方面提供入门之道。

实验一  柱层析的应用

四季青中酚性化合物（原儿茶酸、原儿茶醛）的分离

【实验的目的和要求】

1．了解掌握常压柱层析的方法、原理

2．常压柱层析在天然药物化学成分分离上的应用

【基本原理】（四季青中酚性化合物（原儿茶酸、原儿茶醛）的基本性质）

原儿茶酸(protocatechuic acid C₂H₄O₄，3、4二羟基苯甲酸)，无色针晶，熔点198~200℃，易溶于水、乙醇、乙醚、丙酮、醋酸乙酯，难溶于苯、氯仿。

原儿茶醛(prooeatechuic aldehyde，C₇H₆O₈ 3、4二羟基苯甲醛)植物体内存在量少，不稳定，易氧化，熔点153~154℃。

【操作方法】

（1）硅胶（100~160目，活度V级）6 g，干法装柱。

（2）样品，5 mg加洗脱剂5 ml加热溶解后过滤，用吸管吸取滤液加入柱顶。

（3）洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯（4∶6）。（先50 ml→再酌量配）

（4）收集洗脱剂：用小三角瓶收集每份10 ml（共收集10份）。

（5）检出：取硅胶CMC-Na小板一块如图划小格，用毛细管吸取各份洗脱液分别滴在各小格内，然后用毛细管取检出试剂2，4-二硝基苯肼、氨性硝酸银试剂滴在检品点处，观察结果，另一格子只滴检出试剂进行空白对照。

*按醛的一般检验方法，采用2，4-二硝基苯肼对原儿茶醛形成腙呈色为正反应

当检出洗脱液至无腙的橙色斑点出现时改用氨性硝酸银试剂检出原儿茶酸。当正反应时应使银—氨络离子的溶液中的银离子被原儿茶酸的邻二酚羟基还原成金属银（Ag⁺—Ag°↓ ）  呈黑色斑点出现。可加热促进反应。

从反应结果可判断出哪几个流份含有原儿茶醛，哪几份含原儿茶酸，或为空白流份。然后将这些流份分别浓缩后点样进行薄层层析检出，薄层层析条件：

硅胶CMC-Na薄层板；

展开剂：氯仿/丙酮/甲醇/醋酸（7∶2∶0.5∶0.5）；

显色剂：2%三氯化铁乙醇溶液显色，

按展层结果合并相同流份，常压回收洗脱液至小体积，抽松后用乙醇为溶剂进行重结晶。抽滤得晶体，取少许晶体以少量乙醇溶解后再进行薄层层析，展层，观察是否为单体，若是单体，就可测熔点进行初步鉴定，已知化合物可做红外吸收光谱图与标准图谱对照证明。

记录各流份的点滴反应，薄层层析的结果（绘出图谱）、写出所得单体的熔点数据。以初步判断分离得单体是什么化合物？

氨性硝酸银试剂(Tollens试剂)：

5%硝酸银溶液2 ml置洁净试管内，加入1滴10%氢氧化钠溶液。逐滴加入20%氨水，同时不断加入振摇，直到氧化银沉淀恰巧溶解为止。为制得灵敏试剂，氨的量不可过量。

本试剂应在临用前配制，因为久放会分解，并会沉积出一种高度爆炸性的沉淀！！

试液点在滤纸上，再点上新鲜配制的试剂，于100℃加热5~10分钟，如果呈深褐色。证明含有醛基的还原糖。

2，4-二硝基苯肼试剂：取2，4-二硝基苯肼配成0.2% 2N盐酸溶液或0.1% 2N盐酸乙醇液。

柱层析时所用的仪器要干燥：

层析柱           1 支                     小三角烧瓶                  15只

吸  管           1 支                     移 液 管1ml               1只

小漏斗           1 只                     玻  棒           1 支                    

实验二  芦丁的提取、分离及鉴定

芦丁(Rutin)亦称芸香苷(Rutinoside)，广泛存在于植物界中，其中以槐花米和荞麦叶含量较高，可作为提取芦丁的原料。槲皮素即芸香苷苷元，可经芦丁水解制得。

槐花米系豆科植物Sophora japonica的花蕾，自古作为止血药。槐花米中所含主要成分芸香苷有减少毛细血管的通透性作用，临床上主要为防治高血压的辅助治疗药物。此外，芦丁对于放射线伤害所引起的出血症亦有一定作用。

【实验的目的和要求】

1．以芦丁为实例学习黄酮类成分的提取分离方法。

2．掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的鉴定方法。

【基本原理】（槐花米中已知主要成分的理化性质）

槐花米中芦丁的含量可高达20%，另含少量皂苷。皂苷水解后，可得到桦皮醇(Betulin C₃₀H₅₀O₂)及槐二醇(Sophoradiol，C₃₀H₅₀O₂)。

1．芦丁（芸香苷，Rutin）：

本品为淡黄色细小针状结晶，C₂₇H₃₆O₁₆·3H₂O，熔点177~178℃，无水物熔点190℃（不完全），214~215℃发泡分解。芦丁溶于热水（1∶200），难溶于冷水（1∶8000）；溶于热甲醇（1：7），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：30），冷乙醇（1∶300），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚及石油醚等溶剂。易溶于碱液中呈黄色，酸化后又析出。

2．槲皮素(Quercetin)：

即芸香苷苷元，为黄色结晶，C₁₅H₁₀O₇·2H₂O，熔点313~314℃，无水物熔点316℃。槲皮素溶于热乙醇（1∶23），冷乙醇（1∶300）。可溶于冰醋酸、乙酸乙酯、丙酮等溶剂。不溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿和水中。

【操作方法】

1自槐花米中提取芦丁：

(1)．提取方法：

取槐花米20g，置于800 ml烧杯中，用冷水快速清洗去泥沙等杂质沥干水，加0.4%硼砂水的沸溶液400 ml，pH6~7左右，在搅拌下以石灰乳调至pH8，加热微沸30分钟，补充失去的水份，并保持pH8，静置约5~10分钟，倾出上清液，用纱布过滤。重复提取一次，合并滤液，将滤液用盐酸调至pH3~4左右，再加8滴氯仿，放置过夜，抽滤，水洗3~4次，放置空气中自然干燥得粗芦丁。

(2)．重结晶方法：

取粗芦丁2 g，加去离子水或蒸馏水400 ml，加热煮沸，趁热抽滤，放置过夜析晶（或放冷析晶），抽滤，得精制芦丁。

思考题：提取芦丁工艺中影响产量与质量的因素是什么？为什么要加硼砂水溶液？

记录：粗芦丁得率多少？精制芦丁得率多少？熔点？

(3)．芦丁的水解：

取芦丁1 g，加2% H₂SO₄ 80 ml，小火加热微沸回流30分钟至1小时。开始加热10分钟为澄清溶液，逐渐析出黄色小针状结晶，即槲皮素，抽滤取结晶（保留滤液20毫升，以检查其中所含单糖），加50%乙醇（按1克90 ml量）加热回流使槲皮素粗晶溶解，趁热抽滤，放置析晶，抽滤得精制品，在减压下110℃干燥可得槲皮素无水物。测熔点，进行薄层层析鉴定。

思考题：芦丁水解水完全时将产生什么结果？

记录：芦丁的水解产物是什么？主要产物得率？熔点？

2 芦丁、槲皮素、糖的鉴定：

(1)．薄层层析：

样  品  自制芦丁、槲皮素

对照品  芦丁、槲此素

展开剂  （1）正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5上层或4∶1∶1）；（2）25%醋酸水溶液；

（3）85%醋酸水溶液

显  色 （1）可见光下观察，再在紫外光下观察；（2）经氨气熏后再观察；

（3）喷三氯化铝试剂后再观察

(2)．芦丁和槲皮素的聚酰胺薄层鉴定：

样  品  同薄层层析

展开剂  乙醇-水（7∶3）

显  色  同薄层层析

(3)．糖的检出——薄层层析法：

取上述滤除槲皮素时保留的水解滤液20 ml，加Ba(OH)₂的细粉（约2.6克）中和至pH7，滤除生成的BaSO₄沉淀，滤液浓缩至约1 ml，供层析点样用。

展开剂  正丁醇-醋酸水（4∶1∶5上层或4∶1∶1）

对照品  葡萄糖、鼠李糖水溶液

显色剂  苯胺邻苯二甲酸盐（试剂喷后，105℃烘十分钟，显棕色或棕红色斑点。）

思考题：芦丁水解不完全时将产生什么结果？芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展开将出现什么结果？为什么？芦丁和槲皮素聚酰胺薄层出现什么结果？为什么？

记录：几种层析示意图

苯胺邻苯二甲酸盐配制：0.93克苯胺，1.66克邻苯二甲酸溶于100毫升水饱和的正丁醇中

三氯化铝试剂：1％三氯化铝乙醇液

【主要仪器及试剂】

仪器:

（1） 烧杯(100ml ,500ml)；（2） 圆底烧瓶(100ml , 150ml)；（3） 冷凝管；（4） 抽滤瓶；

（5） 循环水泵；（6） 紫外灯

试剂:

(1) 0.4%硼砂水；（2）石灰乳；（3） 乙醇， 甲醇等；（4） 2%硫酸， 盐酸；（5） 氢氧化钡；

（6） 三氯化铝；（7） 正丁醇:醋酸:水(4:1:5 或4:1:1)；（8） 25%醋酸, 85% 醋酸；（9） 乙醇:水(7:3)；（10）标准品:芦丁,槲皮素,葡萄糖,鼠李糖

实验三  天然产物化学成分系统预试验

天然产物中所含的化学成分种类很多，在深入研究之前应首先了解其中含有哪些类型的化学成分，如生物碱、皂苷、黄酮类等等。这就需要进行各类化学成分的系统定性预试验。或根据研究的需要进行单项预试法来初步判断。利用各类成分的颜色反应和沉淀反应，对天然产物的提取液进行检查可以初步判断其中的化学成分。由于提取液大多数颜色较深，影响对颜色变化的观察，可以使用薄层层析（TLC）或纸层析（PC）等方法对天然产物的提取液进行初步分离，再进一步检查。

【实验目的】

掌握未知成分的天然产物是怎样初步提取分离的，熟悉各主要成分的试管试验、沉淀反应和纸层析、薄层层析的方法并根据试验结果判断含有什么类型的化学成分。

【实验步骤】

利用不同成分在各种溶剂中的溶解度的不同，一般可采用以下3种溶剂分别提取，试验。

1．水浸液：

取中草药粗粉5 g加水60 ml，在50~60℃的水浴上加热1小时，过滤，滤液作下列试验。

^*在试管进行，△在滤纸或硅胶CMC-Na薄层板上进行，下同。

2．乙醇提取液

取中草药粗粉10 g，加5~12倍量95%乙醇，在水浴上加热回流提取1小时，过滤，滤液留2 ml作（1）项试验，其余回收乙醇至无醇味，并浓缩成浸膏状，浸膏分为二部分，一部分加少量2% HC振摇溶过滤。分出酸液，作（2）项式验，附于滤纸上的一部分再以少量乙醇溶解，溶液作（3）项试验；另一部分浸膏以少量乙酸乙酯溶解，溶液置分液漏斗中加适量5% NaOH振摇，使酚性物质及有机酸等转入下层氢氧化钠水溶液中，剩下的乙酸乙酯为中性部分，用蒸馏水洗去碱性即可备用，将乙酸乙酯液2~3 ml，在水浴上蒸干，以1~2 ml乙醇溶解作（4）项试验。

（1）项试验

（2）项试验

（3）项试验

（4）项试验

3、石油醚提取液

取中草药粗粉1 g，加10 ml石油醚（沸程60~90℃），放置2~3小时，过滤，滤液置表面皿上任其挥发，残留物进行下列试验：

4、氰苷的检查

取中草药粗分0.2克，置于试管中，加入3~5 ml 5%硫酸溶液，摇匀混合，在试管口置一条浸泡过苦味酸钠盐溶液的滤纸条，然后塞紧试管口（滤纸不要接触溶液），试管于沸水浴上加热十几分钟，如纸条呈红色表示有氰苷。

中草药化学成分的预试，除上述颜色反应及沉淀反应外，如能配合层析方法，不仅可以减少成分间的相互干扰，而且可以根据其极性及溶解性能（通过所用展开剂及R_f值判断）较为正确地判断中草药中所含的化学成分。

各类成分的层析预试条件大致如下，尚可根据具体对象适当调整展开剂的比例。

天然物化学成分的鉴别

一、生物碱

样品制备：取药材的水溶液加2%盐酸（或1%醋酸）至酸性，或取药材乙醇提取物加同上酸液溶解部分，置小试管中，分别滴加下列生物碱沉淀剂1~2滴，观察并记录变色现象（沉淀、混浊、结晶、颜色）。本反应也可用毛细管取样品点于薄层板上，再滴加试剂观察变化（与空白对照）。

沉淀试剂：

（1）碘化铋(Dragendorff)试剂：出现桔红色或黄色沉淀。

（2）碘化汞钾(Mayer)试剂：出现白色或淡黄色沉淀。

（3）硅钨酸(Bertrand)试剂：出现淡黄色或灰白色沉淀，在薄层板上应时，加热后出现黑色斑点。

（4）苦味酸(Hager)试剂，样品液需调至中性后加试剂，出现黄色晶形沉淀。

记录：                                                                    

样品名称：                                                                 

结果现象：                                                                

                                                                              

薄层分析：

硅胶-CMC-Na薄层

样  品：巴马汀，小檗碱，药根碱，延胡索乙素，制备巴马汀后的母液，盐析后的水母液。

展开剂：氯仿——甲醇（3∶1），展开前薄层板先在氨缸中饱和5分钟。或氨水放在小烧杯内，

置展开缸中

显  色：先在紫外灯下观察萤光，然后再喷以改良碘化铋钾试液显色。

如果用中性或碱性氧化铝薄层，展开剂可用氯仿。

记  录：薄层层析图谱，说明各母液中还有什么化合物。

二、酚类、鞣质（用水或乙醇浸出液进行检查）

（1）1%三氯化铁水或乙醇试剂，试液应为酸性，滴加试剂，出现蓝、绿或蓝紫色。也可以在滤纸片上进行。

（2）三氯化铁——铁氰化钾试剂：1%三氯化铁水溶液，1%铁氰化钾水溶液，临用时等体积混合。将试液点在滤纸上，滴加试剂，立即呈明显的蓝图色斑点。但时间长后背景也渐呈蓝色。

（3）明胶试剂：0.5%的明胶水溶液加等量的10%氯化钠溶液。试液滴加试剂产生沉淀，证明含有鞣质。

三、有机酸（用水或乙醇浸出液进行检查）

（1）pH试纸检查：应呈酸性

（2）溴甲酚绿试剂：1%溴甲酚绿乙醇（70%乙醇）溶液。将试液点于滤纸上，滴加试剂立即在蓝色的背景上显黄色斑点，若不明显，再喷洒氨水，然后暴露在盐酸气体中，背景逐渐由蓝图色变为黄色，而有机酸盐的斑点仍为蓝色进一步证明。

四、氨基酸、蛋白质、肽（用在60℃以下加热浸出的水溶液检查）

（1）茚三酮(Ninnydrin)试剂：0.2%茚三酮乙醇溶液。试液于滤纸上，摘上试剂后在110℃左右的烘箱中放置2分钟，如有氨基酸、肽应呈紫红色或蓝色斑点。少数呈黄色斑点。

（2）双缩脲反应(Biuret reaction)试剂  1%硫酸酮水溶液和40%氢氧化钠水溶液等量混合。取1毫升水浸液加入试剂1~2滴，振摇，冷时显紫红色，可能有蛋白质或肽。

五、糖、多糖和苷(用水或稀醇溶液检查)

（1）酚醛缩合反应(α-萘酚试剂、Molish试剂)：10%α-萘酚乙醇溶液，浓硫酸。试液置试管内，加入试剂1~2滴，振摇后，倾斜试管，沿管壁加入浓硫酸数滴，在两液的接触面产生紫红色环即有还原糖。

（2）菲林氏反应(Fehling试剂)：

溶液Ⅰ：69.3克结晶硫酸铜溶于1000毫升水中。

溶液Ⅱ：349克洒石酸钾钠及氢氧化钠100克，溶于1000毫升水中。

上述二溶液如不清可滤过。临用前等体积混合。

水试液加菲林氏液等量，摇匀，在沸水浴上加热2~3分钟，如果产生砖红色氧化亚酮沉淀，证明含有还原糖。

若试液中不含还原糖，可加6N  HCl酸化，加热煮沸数分钟至半小时，冷后仔细观察有无絮状沉淀。如果产生沉淀，表明可能含有苷或低聚糖。将滤液加碳酸钠中和至碱性，然后再加等量菲林氏液，摇匀，在沸水浴上加热2~3分钟，如果产生氧化亚酮沉淀，证明苷或多糖已水解产生还原糖。此时氧化亚铜的沉淀比水解前增加。

（3）氨性硝酸银试剂(Tollens试剂)：

5%硝酸银溶液2 ml置洁净试管内，加入1滴10%氢氧化钠溶液。逐滴加入20%氨水，同时不断加入振摇，直到氧化银沉淀恰巧溶解为止。为制得灵敏试剂，氨的量不可过量。

本试剂应在临用前配制，因为久放会分解，并会沉积出一种高度爆炸性的沉淀！！

试液点在滤纸上，再点上新鲜配制的试剂，于100℃加热5~10分钟，如果呈深褐色。证明含有醛基的还原糖。

（4）苯胺——邻苯二甲酸盐：

0.93克苯胺，1.66克邻苯二甲酸溶于100 ml水饱和的正丁醇中。将试液点于滤纸上，再滴上试液，在105℃加热10分钟。还原糖呈桃红色。有时也呈棕色斑点。呈红色为戊醛糖和2-己酮糖酸。呈棕色为己醛糖和5-己酮糖酸。

（5）醋酸铅水溶液、碳式醋酸铅水溶液：为了进一步确证是苷类。将试液加醋酸铅饱和水溶液。如果产生沉淀，就可能含有有机酸、粘液质、鞣质、蛋白质和苷类。俟沉淀完全后，滤去沉淀，滤液加碱式醋酸铅饱和水溶液，如果沉淀就可能含有苷类。

（6）碘液或碘化钾——碘试液(wagner试剂)：5%碘的氯仿溶液。1克碘及10克碘化钾，溶于50毫升水中，加热，加2毫升醋酸，再用水稀释至100毫升)。

为了进一步确证是多糖，取试液的浓缩水溶液1毫升，加5倍量的乙醇使产生沉淀，加热过滤，并用少量热乙醇洗涤。将此沉淀溶于3毫升水中，进行多糖试验。取此试液1毫升，加少量碘液或Wagner试剂。如呈褐色则为糊精。蓝黑色则为地衣糖。蓝色加热后消失则为沉淀。

（7）皂苷

①泡沫试验：取穿山龙的水浸出液2毫升置小试管中。用力振摇1分钟，如产生多量泡沫，放置10分钟，泡沫没有显著消失，即表明含有皂苷。另取试管二支，各加入穿山龙热水溶液1毫升，一管内加入2毫升0.1N氢氧化钠溶液，另一管加入2毫升0.1N盐酸溶液，将两管塞紧用力振摇1分钟，观察两管出现泡沫的情况，如两管的泡沫高度相近，表明为三萜皂苷，如含碱液管比含酸液管的泡沫高过数倍，表明含有甾体皂苷。

②溶血试验

取清洁试管二支，其中一支加入蒸馏水0.5 ml，另一试管加入穿山龙的水浸出液0.5ml，然后分别加入0.5 ml 0.8% NaCl水溶液，摇匀，再加入1 ml 2%红血球悬浮液，充分摇匀，观察溶血现象。

根据下列标准判断实验结果：

全溶——试管中溶液透明为鲜红色，管底无又红色沉淀物。

不溶——试管中溶液透明为无色，管底沉着大量红血球，振摇立即发生浑浊。

（8）皂苷元

将所提取的薯芋皂苷元进行下列试验

（Ⅰ）磷钼酸试剂（3~10%乙醇液）

薯芋皂苷元重结晶的乙醇母液点于滤纸片或硅胶薄板上，点加磷钼酸试剂，略加热，颜色变蓝色，与空白对照。

（Ⅱ）三氯醋酸试剂(Rosen-Heimer)

薯芋皂苷元结晶少许置于干燥试管中，加同量固体三氯醋酸放在60℃~70℃恒温水浴中加热；数分钟后由红→紫色、为甾体皂苷。若加热至100℃变色红→紫，应为三萜类皂苷。

（Ⅲ）硫酸—醋酐试剂(Liedermann-Burchard)

薯芋皂苷元结晶少许，置白磁板上，加硫酸—醋酐试剂2~3滴，观察颜色由红→紫→兰，放置后变污绿色。

（Ⅳ）浓硫酸试剂

薯芋皂苷元结晶少许，置白磁板上，加浓硫酸2滴，观察颜色变化，由红紫久置后变污绿色。

薄层层析：

薄层板：硅胶CMC-Na板

样  品：薯芋皂苷元粗品、乙醇重结晶母液，薯芋皂苷元精制品乙醇液。

对照品：薯芋皂苷元标准品乙醇溶液

展开剂：石油醚/乙酸乙酯（7∶3）

显色剂：5%磷钼酸乙醇液，喷雾后加热，显蓝色斑点。

（9）黄酮类

（Ⅰ）盐酸——镁粉反应

取样品（芒丁、槲皮素）1 mg置于试管内，加50%乙醇2 ml，在水浴上加热溶解，滴加浓盐酸2滴，再加镁粉约50 mg。溶液由黄色变为红色。

（Ⅱ）氨熏：取水溶液试样滴于滤纸，在浓氨水瓶上熏，立即置于紫外灯下观察，呈黄色亮萤光斑点。

（Ⅲ）1%三氯化铝乙醇溶液：将水试液滴在滤纸上，再滴上试剂，呈黄色斑点。干后置紫外灯下观察显亮黄色萤光斑点。

（Ⅳ）硼氢化钾（钠）反应

专门还原二氢黄酮而呈现红至紫色。

取橙皮苷溶于50%乙醇液5滴，置干试管内，加硼氢化钾一粒（米粒大），再滴加浓盐酸，观察呈现颜色变化。

（Ⅴ）醋酸镁反应

取样品（芦丁、檬皮苷）数毫克，溶于50%乙醇中，在试管中或点样于滤纸上，加1%醋酸镁甲醇液，黄酮类（芦丁）呈黄色萤光，二氢黄酮类（橙皮苷）呈天兰色萤光。

（Ⅵ）浓硫酸反应

取芦丁数毫克置于白色有孔磁板上，滴加浓硫酸后成锌盐，呈橙色，待加酸溶解后，加较多量水稀释后转为浅黄色，并析出芦丁黄色沉淀。

（Ⅶ）锆—柠檬酸反应  即槲皮素、黄芩素各0.1 mg，分别置于试管内，加甲醇于水浴上加热溶解，再分别加2%二氯化锆3~4滴，凡有3—OH的黄酮即呈鲜黄色，然后分别加2%柠檬酸甲醇溶液3~4滴，具有C₃—OH的黄酮黄色不褪，具有C₅—OH的黄酮黄色减退。

（Ⅷ）1%三氯化铁乙醇液

取试液滴于滤纸上，再滴试液，观察颜色。（酚羟基反应）

（10）香豆素：

（Ⅰ）萤光  秦皮的极稀溶液发生兰色萤光，若加氨水后，呈显著黄色。（成盐）

（Ⅱ）1%三氯化铁水溶液

秦皮的水溶液，加1%三氯化铁溶液数滴，呈兰绿色，若再加入氨水，转为污红色。

（Ⅲ）异羟肟酸铁反应（羟胺反应）

取1%香豆素甲醇液1 ml，置于小试管中，加新鲜的1N盐酸羟胺甲醇液0.5 ml，加2NKOH甲醇液0.5 ml使溶液呈碱性，在水浴上微热，冷却后加1% FeCl₃的1%盐酸液1~2滴，然后滴加5% HCl使溶液呈微酸性，若有紫红色呈现，表明含有香豆素及其它内酯化合物和酯类化合物。

（Ⅳ）Gibb氏反应：

此反应必须有游离酚羟基，且酚羟基对位无取代者，才能呈阳性反应。本试剂在弱碱性条件下与酚羟基对位活性氢缩合成兰色物。

试剂：甲：0.5% 2.6-二氯苯醌-4-氯亚胺的乙醇溶液。

乙：硼酸—氯化钾—氢氧化钠缓冲液^*（pH9.4）

用毛细管将7，8-二羟基香豆素，7-羟基香豆素乙醇液滴在滤纸上，吹干再用毛细管滴试剂甲，待干，再滴加试剂乙，正反应即呈深兰色~兰色。

（Ⅴ）4-氨基安替比林-铁氰化钾(Emerson)：检查酚类。

A：2% 4-氨基安替比林乙醇溶液；

B：8%铁氰化钾水溶液。

或用0.9% 4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液。

方法：将试液滴于滤纸上，先喷洒Ⅰ，再喷洒Ⅱ，即呈色，或再放放密闭缸内，缸内放25%氢氧化铵，即产生橙红至深红色。

（Ⅵ）内酯化合物的开环闭环反应：

取1毫升乙醇浸出液，加2毫升1%氢氧化钠，于沸水浴中煮3~4分钟，液体化未加热前清晰。说明开环，再加2%盐酸酸化，液体变为混浊。说明闭环，有时产生沉淀。

（11）强心苷：

显色反应可由苷元及2，6-去氧糖两部分产生。

（Ⅰ）强心苷元具有甾体母核反应，也具有不饱和五元内酯的反应。

甲型强心苷在碱性溶液中能与活性次甲基试剂作用而呈色。

①亚硝基铁氰化钠-氢氧化钠（Legal试剂）：检查不饱和内酯，甲基酮或活性次甲基，常用于强心苷等。

喷洒剂：1克亚硝基铁氰化钠溶于100 ml 2N氢氧化钠—乙醇（1∶1）的水溶液。

显红色或紫色斑点。

②3，5-二硝基苯甲酸（Kedde试剂）：检查强心苷，α、β-不饱和内酯。

喷洒剂：1克3，5-二硝基苯甲酸溶于50毫升甲醇，加入1N氢氧化钾50毫升。

强心苷呈紫红色斑点。

③Baljet反应：取毛花洋地黄总苷的醇溶液滴于硅胶板上，加上新鲜配制的碱性甘味酸试剂（1%苦味酸乙醇溶液和5%氢氧化钠水溶液等量混合）一滴，呈现橙或橙红色。此反应有时发生较慢，需放置15分钟后才显色。空白对照。

④氯胺T—三氯醋酸：检查强心苷。

喷洒剂：Ⅰ、3%氨胺T水溶液新鲜制备。

Ⅱ、25%三氯醋酸乙醇溶液（能保存整天）。

10毫升Ⅰ加40毫升Ⅱ，用前混合。

喷洒后处理：110℃热7分钟，紫外线荧光分析下检示呈蓝色或黄色荧光，

（Ⅱ）2，6-去氧糖的颜色反应：

Keller-Killani反应：取毛花洋地黄总苷1 mg溶于1 ml冰醋酸，加一滴2%三氯化铁水溶液，置试管中，沿管壁注入0.5 ml浓硫酸，观察界面和醋酸层的颜色的变化。如有2，6-去氧糖存在，醋酸层渐呈兰色。

占吨氢醇（xanthydrol）反应：取毛花洋地黄总苷的乙醇液滴在硅胶板上再加占吨氢醇试剂1滴，电吹风加热三分钟，呈红色。

（12）挥发油

香草醛一浓硫酸试剂：

5%香草醛浓硫酸乙醇液（或0.5克香草醛溶解于100毫升硫酸/95%乙醇（4∶1）中）