注:1、报告内的项目或内容设置,可根据实际情况加以调整和补充。
2、学生提交实验报告时间为实验后10日内。
题目:水稻DNA提取,扩增与电泳实验
组别:第三组
一、1掌握DNA的提取技术2掌握PCR的相关操作3掌握了解电泳操作方法和步骤
二、实验原理:1、提取DNA一般用水稻幼叶,先用机械方法液氮研磨植物组织使组织细胞破碎,然后加TPS抽提液水浴提取DNA,最后用无水乙醇沉淀DNA即可。(DNA提取原理)
2、DNA在高温时可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。(PCR原理)3、琼脂糖凝胶电泳:借助琼脂糖凝胶的分子筛作用,核酸片段因其分子量或分子形状不同,电泳移动速度有差异而分离。
三、实验仪器和药品
液氮、镊子、手套、移液枪、枪头2ML和1.5ML离心管、水稻幼叶、研磨棒、琼脂糖、天平、PCR仪、Loading Buffer染色剂、灭菌双蒸水、摇床、离心仪、Taq酶、Mg2+Buffer、dNTP溶液、引物、TPS抽提液、无水乙醇、电泳槽、GoldView、TBE溶液、微波炉、锥形瓶、量筒、PCR板、PCR盖、水浴箱、Marker
四、实验步骤
1、DNA提取
(1)取水稻叶子少量置于2ML离心管内,加入液氮研磨,带磨成粉状后,加1MLTPS抽提液,然后将离心管放入75℃恒温水浴箱中至少半小时。同时将无水乙醇放入-40℃下冷冻
(2)水域结束后,取出离心管放入离心仪中,13600r/min离心12min,然后小心的取出离心管,将上清液转移到1.5ml离心管中0.5ml,加入600ul冷冻的无水乙醇,放入-80℃下冻10min,拿出放入离心仪13600r/min离心5min
(3)到处上清液,倒置,晾干约3h
(4)加入双灭菌水60ml,放入摇床中振荡一夜。
2、PCR
(1)按所需配料表,向PCR板中加入双蒸水,mix,前引物,后引物,然后加入提取的DNA,混匀
(2)将PCR板放入PCR仪中运行SSR程序
3、电泳
(1)称取0.3g琼脂糖和30mlTBE溶液。混匀倒入锥形瓶中,加热溶解混匀。待冷却至不烫手时加入GoldView,混匀,倒入已经插好梳子的配胶槽中,冷却30min至1h
(2)将冷却好的凝胶拔掉梳子后放入电泳槽中(将有点样孔的一端靠近负极)然后按照顺序点样,每个样的用来那个为4ul,在中间的空上点Marker溶液3ul
(3)打开电泳开关,电泳32min左右
(4)电泳结束后,将胶取出,放入透视镜下照射,拍照,读带
五注意事项
1、 提取dna的时候用乙醇是沉淀时,必须将乙醇冰冻
2、 在PCR之前加2ulDNA时要将枪头插入液面下
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