医学免疫学实验指导

供基础、预防、口腔、麻醉、药学、临床医学类专业用

泸州医学院

二零##年六月

目录

机体的天然免疫…………………………………………………………………………………（）

实验一、溶菌酶的溶菌作用………………………………………………………………（）

实验二、中性粒细胞的吞噬作用…………………………………………………………（）

实验三、巨噬细胞的吞噬作用……………………………………………………………（）

凝集反应…………………………………………………………………………………………（）

实验四、直接凝集反应……………………………………………………………………（）

实验五、间接凝集反应……………………………………………………………………（）

沉淀反应…………………………………………………………………………………………（）

实验六、环状沉淀反应……………………………………………………………………（）

实验七、单向免疫扩散试验………………………………………………………………（）

实验八、双向免疫扩散试验………………………………………………………………（）

实验九、对流免疫电泳试验………………………………………………………………（）

实验十、火箭免疫电泳试验………………………………………………………………（）

实验十一、免疫电泳试验…………………………………………………………………（）

补体参与的反应…………………………………………………………………………………（）

实验十二、补体结合试验…………………………………………………………………（）

实验十三、总补体活性测定………………………………………………………………（）

实验十四、免疫荧光技术…………………………………………………………………（）

实验十五、流式细胞术……………………………………………………………………（）

实验十六、酶联免疫吸附试验……………………………………………………………（）

实验十七、放射免疫测定法………………………………………………………………（）

免疫细胞的检测…………………………………………………………………………………（）

实验十八、外周血单个核细胞的分离与纯化……………………………………………（）

实验十九、E玫瑰花结试验………………………………………………………………（）

实验二十、溶血空斑试验…………………………………………………………………（）

变态反应…………………………………………………………………………………………（）

实验二十一、动物过敏试验………………………………………………………………（）

实验二十二、肥大细胞过敏试验…………………………………………………………（）

综合性试验………………………………………………………………………………………（）

实验二十三、T淋巴细胞亚群的检测……………………………………………………（）

实验二十四、T淋巴细胞转化试验………………………………………………………（）

实验二十五、人体外周血中NK细胞活性检测…………………………………………（）

设计性试验………………………………………………………………………………………（）

    实验二十六、可溶性抗原定量检测的设计…………………………………………………（）

机体的天然免疫

（Natural immune of organism）

内容：

一、溶菌酶的溶菌作用

二、中性粒细胞的吞噬作用

三、巨噬细胞的吞噬作用

机体先天遗传形成的天然免疫力具有非特异性保护作用，主要由机体正常生理屏障、正常体液杀菌物质（如溶菌酶）、大小吞噬细胞与自然杀伤细胞（NK）等共同构成。

试验一、溶菌酶的溶菌作用

溶菌酶（lysozyme）主要由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子蛋白质，属乙酰氨基多糖酶。它的等电点高（PH 11.0），能与细菌牢固的结合，并裂解肽聚糖中N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，使细菌溶解死亡。革兰氏阴性菌肽聚糖层少，又有外膜保护，故在一般情况下不受溶菌酶的影响。

溶菌酶广泛分布于机体的组织、体液与分泌液，其中泪液含量最高，约血清的100~150倍。临床慢性支气管炎，局部免疫功能降低，唾液中溶菌酶低于正常，各种类型的白血病患者血清和尿中溶菌酶含量有所增加。

【材料】

⒈ 唾液、泪液（或乳汁）、标准溶菌酶（1ng/ml）、生理盐水、2~5%琼脂盐水。

⒉ 细球菌（M.lysodeikticus）。

【结果】

孔周或滤纸片周围出现的透明圈即为溶菌环。注意比较溶菌环的大小。

【注意事项】

⒈ 加样时，样品避免溢出孔外，孔内不应有气泡。

⒉ 作定量检测时，先要用标准品制备标准曲线，然后根据环的直径及标准曲线求出样品含量。

⒊ 标准曲线绘制后，每次检验样品时，最好在同一平皿上备有标准品的对照，以资比较。

【思考题】

溶菌酶的溶菌作用有什么生物学意义？

【附录】

⒈   细菌悬液的配制：无菌吸取5ml PH6.4，1/15M PBS 加到细球菌培养管中，置室温5~10分钟。旋转培养管，制成菌悬液。用分光光度计（波长640nm）测定并调整细菌细胞浓度达到透光率为30~40%。

⒉     溶菌酶标准液的配制：称取溶菌酶标准纯品，PH6.4，1/15M PBS 配成1000ug/ml (1ng/ml)，置冰箱冻存。临用时再稀释成100，50，25，10ug/ml。

⒊     标准曲线的绘制：

⑴ 取一无菌平皿（直径9cm），倾入7.5ml细球菌悬液，再倾入7.5ml已溶化的2.5%琼脂盐水，迅速混匀，平放待凝。

⑵ 凝固后，用打孔器打孔，孔间距约1.5cm，每平皿可打孔8~9个。

⑶ 各孔内依次加入不同浓度的溶菌酶标准品，每孔20ml。

⑷ 置于37℃，18~24小时。测量溶菌环的直径。

⑸ 以溶菌酶标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），溶菌环直径为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。

试验二、中性粒细胞的吞噬作用

（Phagocytosis of neutrophilic granulocyte）

本实验将中性粒细胞与可被吞噬而又易于计数的颗粒物质（如金黄色葡萄球菌）混合孵育一定时间后，颗粒物质被中性粒细胞吞噬。计算吞噬率和吞噬指数，因此，反映该细胞的吞噬功能。

【材料】

⒈     豚鼠。

⒉ 葡萄球菌悬液。

⒊ 3.8%枸橼酸钠溶液、无菌注射器和针头、试管、毛细吸管、瑞氏染料、载玻片等。

【方法】

⒈ 采集豚鼠心脏血1~2ml或取人外周抗凝血2ml，加入到装有3.8%枸橼酸钠0.2ml的试管中，迅速混匀。

⒉ 加入葡萄球菌悬液一滴，混匀。37℃恒温箱内静置30~60分钟。

⒊ 用毛细吸管从白细胞层（即沉淀的红细胞表面）吸取白细胞悬液，加一滴于载玻片一端，作推片，自然干燥。

⒋ Wright 染色：

⑴ 标本自然干燥后，加瑞氏染液2~3滴于标本的涂膜上，染色1分钟。

⑵ 加等量PBS与染液混合均匀，染色5~8分钟。

⑶ 冲去染液。水冲时为防止染液粘附于涂膜，不能先倾倒掉染液，而要边冲边慢慢倾斜载玻片，直至染液冲尽。

⑷ 干燥后油镜下观察。计算中性粒细胞的吞噬百分率及吞噬指数。

【结果】

油镜下见中性粒细胞核呈深紫红色，分叶明显，胞浆呈淡红色，细菌被吞入胞浆，呈紫色。随机数100个中性粒细胞，分别计数吞噬有细菌的中性粒细胞数和所吞噬的细菌总数，按照下列公式，计算出吞噬百分率和吞噬指数。

            100个中性粒细胞中吞噬细胞的中性粒细胞数

吞噬百分率= ────────────────────×100%

                    100（中性粒细胞数）

          　 100个中性粒细胞吞噬的细菌总数

吞噬指数=　─────────────────

　　　　　　　　 100（中性粒细胞数）

【注意事项】

⒈ 所用器材要洁净。

⒉ 愈接近片子末梢细胞数愈多，计数时应取片子前、中、后三段计数，以提高准确性。

试验三、巨噬细胞的吞噬作用

（Phagocytosis of macrophage）

巨噬细胞对颗粒性物质具有强大的吞噬作用。将待测巨噬细胞与吞噬颗粒（如鸡红细胞、酵母细胞等）混合温育一定时间后，颗粒物质可被巨噬细胞吞噬。根据吞噬百分率和吞噬指数可反映巨噬细胞的吞噬功能。

【材料】

⒈ 豚鼠。

⒉ 5%淀粉肉汤液、Hank＇s液、5%鸡红细胞悬液、无菌注射器和针头、毛细吸管等。

⒊ 瑞氏染液。

【方法】

⒈ 实验前1天，给豚鼠腹腔内注射5%淀粉肉汤液6 ml。

⒉ 实验当天，给豚鼠腹腔内注入Hank＇s液6 ml或重复注射5%淀粉肉汤液一次，轻柔腹部。

⒊ 1小时后，给豚鼠腹腔内注射洗涤过的5%鸡红细胞悬液3ml，轻柔腹部。

⒋ 2小时后，用注射器抽取腹腔内的液体，制成推片，自然干燥后作瑞氏染色，油镜观察。

【结果】

油镜下可见巨噬细胞核成深紫红色，胞浆着色浅，呈灰蓝色，被吞噬的鸡红细胞胞浆呈红色，核呈蓝色。一个以上的鸡红细胞，巨噬细胞核常被挤在细胞的边缘。随机计数200个巨噬细胞，分别计数吞噬有鸡红细胞的细胞数和所吞噬的鸡红细胞总数。按下列公式分别算出吞噬百分率和吞噬指数。

            200个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数

吞噬百分率= ────────────────────×100%

                    200（巨噬细胞数）

          　 200个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数

吞噬指数=　─────────────────

　　　　　　　　 200（巨噬细胞数）

【注意事项】

⒈ 鸡红细胞为有核的椭圆形细胞，被巨噬细胞吞噬于胞浆内，随着取腹腔液推片时间延长，鸡红细胞的形象逐渐模糊不清，提示逐渐被消化。因此，必须掌握好时间。

⒉ 计数应不少于200个巨噬细胞。计数少影响结果的可靠性。

【思考题】

1． 为什么吞噬细胞是机体抗感染的重要防线？如果吞噬功能丧失，对机体有什么影响？

2． 检测吞噬细胞的吞噬作用是否全面反映机体的吞噬功能？为什么？

凝集反应

内容：

四、直接凝集反应

（一）         玻片凝集反应—细菌的鉴定、ABO血型鉴定

（二）         试管凝集反应

五、间接凝集反应

（一）   正向间接凝集反应—间接凝集乳胶试验、间接血凝试验

（二）   反向间接凝集反应—反向间接血凝试验、协同凝集试验

（三）   间接凝集抑制试验

试验四、直接凝集反应

（Direct agglutination reaction）

细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下直接与相应的抗体结合形成肉眼可见的凝集块，称为直接凝集反应。常用的直接凝集试验有玻片法和试管法两种。

㈠ 玻片凝集反应（Slide agglutination test）

玻片凝集反应是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质（如细菌，红细胞等）在玻片上混合，在有适当的电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合，形成肉眼可见凝集物，即为阳性；如两者不对应，便无凝集物出现，即为阴性。此法属定性试验，主要用于细菌鉴定和分型、人类红细胞ABO血型的鉴定等。

⒈     细菌的鉴定：

【材料】

⑴ 1∶20稀释的伤寒杆菌的诊断血清。

⑵ 伤寒杆菌、大肠杆菌18~24小时培养物、生理盐水。

⑶ 洁净载玻片、接种环、酒精灯、记号笔等。

【方法】

⑴ 取洁净载玻片一张，用记号笔划分为三格，并依次编号为1、2、3。

⑵ 用灭菌的接种环取生理盐水于玻片的三格内，各加2~3环。

⑶ 将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，冷却后自平皿挑取少量大肠杆菌置于第2格生理盐水中混匀。然后，同法分别取少许伤寒杆菌于第1格及第3格，与生理盐水混匀。

⑷ 用灭菌接种环于第2格加伤寒杆菌诊断血清2~3环并混匀，同法取伤寒杆菌诊断血清2~3环，加于第1格中混匀。

⑸ 轻摇玻片，静置1~2分钟后，观察结果，

【结果】

如上述混合悬液由均匀混浊状变为澄清透明，并出现大小不等的乳白色凝集块者为阳性；如混合物仍呈均匀混浊，无凝集物者为阴性。

【注意事项】

⑴ 每一待检菌均须作生理盐水对照，如对照凝集则表示细菌发生自凝，试验无效。

⑵ 取细菌培养物时，不宜过多。与诊断血清或生理盐水混合时，必须将细菌涂散，涂均匀，但不宜涂得太宽，以免很快干涸而影响结果。

⑶ 伤寒杆菌为肠道致病菌，在实验中务必严格无菌操作，遵守实验规则，用后的载玻片应立即放入盛有消毒剂的容器内。

⒉　ABO血型鉴定

【材料】

⑴ 抗A标准血清、抗B标准血清。

⑵ 载玻片、采血针、碘酒和酒精棉球、牙签、生理盐水、毛细吸管等。

【方法】

⑴ 取洁净载玻片一张，用记号笔分为两格，于上角分别注明A、B字样。

⑵ 用毛细吸管取生理盐水于玻片的两格内各加一滴。

⑶ 用碘酒酒精棉球消毒耳垂或手指尖，采血1~2滴混入玻片上的生理盐水中，迅速用牙签混匀，制成血球悬液。

⑷　在两格血球悬液中分别加抗A标准血清和抗B标准血清一滴，分别用牙签两端搅拌混匀，2~5分钟后摇晃玻片，观察结果。                                        ？

【结果】

混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块者即为红细胞凝集；若混合液仍呈均匀混浊状，无凝集块，则表明红细胞未发生凝集。血型鉴定试验结果及鉴定见表  

                    表         血型鉴定试验结果判定          

                                        诊断血清              

                  血型           抗A              抗B       

                   A              ＋                －        

                   B              －                ＋        

                  A B             ＋                ＋         

                   O              －                －         

                                “＋”表示凝集 “－”表示不凝集

【注意事项】

⑴ 试验用载玻片要清洁，并务必注明A和B字样。

⑵ 待检红细胞悬液不宜过稀或过浓。

⑶ 要及时观察结果，以防时间过长使标本干涸而影响结果的观察和判定。

㈡试管凝集试验

本试验是用已知的颗粒性抗原来检测未知的抗体及其相对含量，此法属定量试验。方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量的已知抗原悬液，经过一定时间后，观察有无凝集并根据凝集程度判定血清抗体的效价。

【材料】

⒈伤寒杆菌H菌液。

⒉伤寒杆菌免疫血清（1∶10稀释）。

⒊生理盐水、小试管、试管架、1ml和5ml刻度吸管等。

【方法】

⒈ 取洁净小试管8支列于试管架上，依次编号。

⒉ 用5ml吸管吸取生理盐水，每管内加入0.5ml。

⒊ 用1ml吸管吸取待检血清0.5ml加入第1管，吹吸3次，充分混匀后，吸出0.5ml加入第2管，如上依次稀释至第7管，自第7管吸出0.5ml弃去。第8管不加血清作为对照管。见图

4． 用5ml吸管吸取伤寒杆菌菌液，从第8管起向前加，每管加入0.5ml。

5．摇匀后，置室温或37℃24小时后，观察结果。操作程序见表

 【结果】

⒈ 凝集强弱，以下列记号表示：

＋＋＋＋：管内液体澄清，细菌全部凝集于管底，轻摇有大片凝集块。

＋＋＋：管内液体轻度混浊，细菌大部分凝集于管底，凝集块较小。

＋＋：管内液体中度混浊，细菌部分凝集于管底，凝集块更细小。

＋：管内液体中度混浊，仅少量细菌凝集。

－：液体混浊，无凝集。若放置较长时间观察结果，未凝集的，细菌亦可沉积于管底。与凝集块沉淀物不同：前者是个小圆点，边缘光滑整齐，而后者似伞状，铺开沉淀于管底，边缘不整齐。

⒉ 首先观察第8管（对照管）。正确结果应是管底沉淀物为圆形，边缘整齐，轻轻振摇，细菌分散呈均匀混浊。若出现了非特异的凝集，则本试验无效。

⒊ 试验管应由第1管看起。H菌液凝集物呈疏松棉絮状，沉于管底，轻摇时易离散和升起。

⒋ 凝集效价的判定：与相应菌液发生中等程度（＋＋）凝集的血清最高稀释度为该被检血清的凝集效价，用稀释倍数表示之。如第1管仍无凝集现象，应报“＜1∶40”，如第7管仍是“＋＋”或更强凝集，应报“＞1∶2560”。

【注意事项】

⒈ 抗原、抗体在比例适当时，才能出现肉眼可见的反应。如果抗体的浓度过高，则无凝集物形成，此为前带现象，需要在测定结果时加以鉴别。

⒉ 判定结果时，应在暗背景下通过强光检查。

⒊ 注意温度、PH、电解质、振摇对本试验的影响。

⒋ 观察结果时，最好不要振摇试管，以免将凝集物摇散而影响他人观察。

试验五、间接凝集反应

（Indirect  agglutination）

间接凝集是将可溶性抗原（或抗体）吸附或偶联在一种与免疫无关的载体颗粒表面，使其成为致敏载体，然后与相应抗体（或抗原）结合，在电解质存在的条件下，发生凝集。

根据载体致敏时所用制剂及反应方式，间接凝集反应有以下几种方法：

㈠ 正向间接凝集反应

将已知可溶性的抗原吸附在载体颗粒表面，与相应的抗体结合所发生的凝集称正向间接凝集反应，见图      。用于检测标本中相应的抗体，如细菌、病毒、螺旋体等以及某些自身抗体（抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等）。

可用作载体的物质有乳胶颗粒、红细胞（人O型红细胞、绵羊红细胞、家兔红细胞等）、聚苯乙烯、活性炭及硅酸铝颗粒等。若所用载体为乳胶颗粒，则称间接乳胶凝集试验，若载体为红细胞，称为间接血凝试验。下面分别以两者为例进行介绍。

图   正相间接凝集反应原理示意图

⒈ 间接乳胶凝集试验（Indirect latex agglutination test）（玻片法）——检测类风湿因子

类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，患者可产生自身抗体，即类风湿因子（一种抗变性IgG的抗体，多为IgM类抗体）。检测类风湿因子可辅助诊断此病。

【材料】

⑴ 待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清。

⑵ 类风湿乳胶诊断试剂（吸附有变性IgG的乳胶颗粒。将IgG经63℃10分钟处理，可获得变性的IgG）。

⑶ 载玻片、毛细滴管等。

【方法】

⑴ 取洁净载玻片一张，用标记笔划分为3格，用毛细滴管分别向3格内加1滴待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清。

⑵再分别向3格内加致敏乳胶1滴，用牙签充分混匀后，摇动玻片2~3分钟后，观察结果。

【结果】

以肉眼观察出现凝集为阳性，不出现凝集为阴性。

玻片法为定性测定，也可以用试管法作定量测定。

【注意事项】

⑴ 试剂应保存在4℃，切勿冻存。使用前应使试剂接近室温并摇匀。

⑵ 日光灯光线不利于观察结果。

⒉ 间接血凝试验(Indirect hemagglutination test)

将可溶性抗原（细菌的提取液）吸附于红细胞，成为抗原致敏的红细胞，这种致敏红细胞与相应抗体作用可产生凝集现象。

【材料】

⑴ 微量血凝板 ：V型孔底，8×12孔

⑵ 稀释棒：一种特制的小铝棒，下接一不锈钢头，中间有米形小缝，吸取量为25ul。

⑶ 抗原致敏的红细胞悬液、稀释液等。

【方法】

⑴ 用微量加样器吸取稀释液，在微量血凝板小孔内各加25ul，每份标本做两排，一排为测定孔，一排为对照孔。一般将受检血清倍比稀释至1∶64，每块血凝板可同时检测8份标本。

⑵ 用稀释棒2支蘸取受检血清后，分别加入测定排和对照排的第1孔，双手搓转稀释棒，使孔内血清和稀释液充分混匀，然后将稀释棒移至第2孔，依同法按顺序作对倍稀释。

⑶ 测定排各加稀释液1滴，对照排各孔加抑制用抗原1滴，放微型振荡器上振荡1~2分钟，盖上一块玻璃板，放37℃保温1小时。

⑷ 各孔加0.5%抗原致敏的红细胞悬液1滴，放微型振荡器上振荡1分钟，移至室温1~2小时，观察结果。

【结果】

凡红细胞沉积于孔底，集中呈一小圆点的为不凝集。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集程度强弱，可分为以下4级：

＋＋＋＋：红细胞形成片层凝集，均匀布满孔底或凝集边缘皱缩如花边状。

＋＋＋：红细胞形成片层凝集，面积略小于＋＋＋＋。

＋＋：红细胞形成片层凝集，面积较小，边缘较松散。

＋：红细胞沉积于孔底，周围有散在的少量凝集。

－：红细胞沉积于孔底，呈小圆盘点状，边缘清晰整齐。

阴性标本表现为两排均不凝集。当两排红细胞孔数相等时，则为非特异性的凝集。

【注意事项】

⑴ 使用器材必须清洁，特别是血凝板要按规定处理，否则对结果影响大。

⑵ 受检血清要新鲜。

⑶ 测定一批标本时，要同时作已知阳性、阴性以及不加受检血清的空白对照。

㈡ 反向间接凝集反应

用特异性抗体致敏（或吸附于）载体颗粒，用于检测标本中相应的抗原。见图

⒈ 反向间接血凝试验(Reversed indirect hemagglutination test)

是用已知的抗体致敏红细胞，检测标本中相应抗原。以检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。

【材料】

⑴ 1∶20抗-HBs致敏红细胞、纯化的1∶20抗-HBs、待检血清、稀释液 。

⑵ “V”型微量血凝板，25ul稀释棒、微量搅拌器、刻度吸管、滴管（40滴/ml）

【方法】

⑴ 配制致敏血球悬液：于每瓶冻干诊断血球加4 ml稀释液，轻轻旋摇使成均匀血球悬液，浓度约为0.6%。

⑵ 正式试验，加样程序见表

① 在“V”型微量血凝板上，每份待检血清设立8孔，于各孔内用40滴/ ml滴管各加1滴稀释液（相当于25 ul/0.025ml）。

② 用25 ul容量的稀释棒蘸满待检血清分别依在各孔内，捻转作对倍稀释（一般每孔内均需捻转10次左右），直至第7孔，第8孔为致敏血球对照，另设第9孔为阳性对照，加25 ul HBsAg阳性血清。

③ 于每孔加入25ul混匀的致敏血球悬液。

④ 将血凝板置于微型振荡器上振荡1~2分钟，置37℃1小时后观察结果：

不凝集：红细胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圆点。

明显凝集（++）红细胞于孔底形成薄膜状凝集，中央可见疏松的红点。

出现明显凝集（++）的血清最高稀释度为HBsAg效价，凡效价≥1∶16者需进一步做中和试验。

⑶ 中和试验：在血凝板上每份标本设测定排和对照排，每排8孔，于每孔加稀释液25ul,用2支稀释蘸被检血清，分别在两排作对倍稀释至第7孔，第8孔不含血清，为血球对照。然后，于测定排各孔加稀释液25ul，对照排各孔 加1∶20抗-HBs25ul。血凝板振荡1~2分钟后，置37℃30分钟，取出，于各孔加25ul致敏血球振摇混匀，置37℃1小时后观察结果。

凡正式试验效价≥1∶16，且中和试验的对照排凝集孔数至少低于测定排凝集孔数2孔，为HBsAg阳性，否则系非特异性凝集。

【注意事项】

⑴ 配置的致敏血球悬液一般在当天用完，若置2~10℃使用期不超过3天。

⑵ 试验用的血凝板、滴管、稀释棒等器材必须十分清洁，否则易造成非特异性凝集。

⑶ 血凝板、稀释棒用后均需用次氯酸钠（10%v/v）浸泡过夜；滴管需煮沸10分钟，然后用水冲净，再用蒸馏水冲洗，晾干备用。

⒉ 协同凝集试验（Coagglutination test）

金黄色葡萄球菌细胞壁上有一种成分，称为葡萄球菌A蛋白（Staphylococcus proteinA，SPA）。SPA能与人及各种哺乳动物（如猪、兔、豚鼠等）血清中的IgG类抗体的Fc端结合，成为致敏的载体颗粒。与SPA结合后的IgG的Fab端可与相应的抗原结合，出现凝集反应，称为协同凝集试验。实际上协同凝集试验也是将已知抗体结合在载体颗粒（葡萄球菌）上，用于检测未知抗原，故亦属反向间接凝集反应。

【材料】

⑴金黄色葡萄球菌CowanⅠ株、含0.5%福尔马林的pH7.4 0.01mol/l PBS、无菌生理盐水。

⑵ 伤寒沙门氏菌可溶性O抗原溶液、伤寒沙门氏菌O抗原免疫血清。

⑶ 载玻片、毛细吸管、接种环等。

【方法】

⑴ SPA菌稳定液的制备：

① 取CowanⅠ菌株接种在肉汤培养基内，置37℃培养18~24小时，再转接于普通平板37℃培养18~24小时。

② 用PBS洗下菌苔，以3000r/min离心15min，洗涤3次，然后用含0.5%福尔马林的pH7.4 0.01mol/l PBS稀释成10%菌悬液，分装保存。

⑵ SPA菌诊断液的制备：

取上述10%SPA菌稳定液1ml，加伤寒沙门氏菌免疫血清混匀，置37℃30分钟，每隔10分钟振荡一次，以3000r/min离心15min，弃上清液，并用PBS洗涤两次，最后加PBS至10 ml。

⑶ 取一洁净玻片分成3格，依次编号。

① 于第1、2格分别加入一滴（约50 ul）SPA菌诊断液，第3格加入一滴（约50 ul）金黄色葡萄球菌液（未致敏SPA菌液）

② 于第1、3格分别加入一滴（约50 ul）伤寒沙门氏菌O抗原溶液，第2格加入一滴生理盐水。

③ 分别用牙签混匀，1~2分钟内观察结果。

【结果】

正确结果应是：第1格内金黄色葡萄球菌凝集成清晰可见的颗粒，液体澄清透明为阳性反应结果；第2、3格为对照，无凝集。

【注意事项】

⑴ 试验前必须仔细检察所用试剂本身有无自凝现象或出现细小颗粒，以免影响观察或导致错误结果。

⑵ 协同凝集试验的特异性取决于致敏免疫血清的特异性，其凝集反应的强弱取决于免疫血清效价。故应选用特异性强和效价高的免疫血清制备SPA菌诊断液。

㈢ 间接凝集抑制试验（Indirect agglutination inhibition test）

若抗原与抗体结合，隔一定时间后再加入该抗原致敏的载体颗粒，此时，因抗体与先加入的抗原结合，而不能再与致敏颗粒结合，不出现凝集现象，称间接凝集抑制试验。若被检材料中无抗原存在，加入抗体后，再加入该抗原致敏颗粒，抗体则与其结合，出现凝集现象。此试验结果，出现凝集，即为阴性，反之为阳性。见图

下面以免疫妊娠为例。

孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。HCG是可溶性的抗原，与抗HCG抗体先作用后，再加入HCG致敏的乳胶颗粒，就不出现凝集，则为妊娠试验阳性；反之，非孕妇尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗体，故抗体与后加入的HCG致敏乳胶结合，呈现凝集，则为妊娠试验阴性。见图 

【材料】

⒈ HCG致敏的聚苯乙烯乳胶颗粒、兔抗人HCG免疫血清、待检尿、孕妇尿（HCG阳性）、阴性尿。

⒉ 玻片、毛细吸管、牙签等。

【方法】

⒈ 取洁净玻片一张分成3格，并注明1、2、3。于3格内分别加1滴待检尿、阴性尿、阳性尿。

⒉ 于每格内分别加兔抗人HCG免疫血清，轻轻摇动或分别用牙签搅动，使充分混匀，静置1~2分钟。

⒊ 于每格内分别加HCG致敏乳胶1滴，轻轻摇动或分别用牙签搅动，静置3~5分钟后观察结果。

【结果】

阳性尿格呈均匀浑浊乳状液。

阴性尿格出现白色细小的凝集物。

【思考题】

⒈ 什么是效价？为什么效价可表示血清中抗体的含量？

⒉ 间接凝集试验主要有哪几种？比较其机理及用途。

沉淀反应

【内容】

六、环状沉淀试验

七、单向免疫扩散试验

八、双向免疫扩散试验

九、对流免疫电泳试验

十、火箭免疫电泳试验

十一、免疫电泳试验

可溶性抗原（如毒素、血清蛋白、细胞碎片）与相应抗体特异性结合，在两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。可溶性抗原与相应抗体相比，抗原分子小，故抗原的反应面积大，为使抗原抗体比例适当，一般应稀释抗原。

试验六、环状沉淀试验

（Ring precipitation test）

将高浓度的抗血清置于直径较小的环状沉淀管中，再缓缓加入血清，使二者间有一清晰界面。如抗原抗体相对应，一段时间后，在液面交界处可形成白色沉淀环。

此试验常用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、鉴定血迹、测定媒介昆虫的嗜血习性等。

【材料】

1、兔抗人血清、人血清、牛血清、生理盐水。

2、毛细吸管、环状沉淀管及环状沉淀管架。

【方法】

1、取环状沉淀管三支置于环状沉淀管架上，做好标记。用毛细吸管加入兔抗人血清各0.2ml于管底。

2、用毛细吸管分别吸取人血清、牛血清、生理盐水0.2ml，沿试管壁缓缓加入三支沉淀管，使两层液体之间有一明显的交界面。

3、室温下静置10~20分钟，观察结果。

【结果】

观察各管两层液体交界面有无白色沉淀环出现，有白色沉淀环的为阳性。（图4—5）

【注意事项】

加下层兔抗人血清时应注意将毛细吸管管口置于沉淀管底，避免气泡产生；加上层液体时毛细吸管不能接触到下层液体，吸管口靠在沉淀管壁上缓缓加入，否则不能形成清晰界面。

试验七、单向免疫扩散试验

（Single immunodiffusion test）

此试验属定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。试验中先将某种已知抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，将需检测的一定量的抗原加入孔中。在反应过程中，抗体已经均匀分布在琼脂板中，只有抗原向四周呈辐射状扩散，故称为单向免疫扩散试验。如果抗原抗体相对应，则在比例适当的地方出现一白色的沉淀环。沉淀环的直径大小与抗原的浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗体反应后测得沉淀环的直径作为纵坐标，以抗原的浓度作为横坐标可绘制标准曲线图。测出待侧抗原在相同条件下的沉淀环直径，即可从标准曲线中求出其含量。此试验主要用于检测血清中各种Ig和补体成分的含量。

【材料】

1、标准参考血清：冻干正常人混合血清，其中IgG含量为经标准标定的已知量，用以制作标准曲线。

2、IgG诊断血清。

3、待检标本：人血清。

4、1.5%琼脂盐水、PBS、载玻片、直径3mm打孔器、微量加样器、湿盒、半对数坐标纸。

【方法】

1、免疫琼脂板的制备：将适宜浓度的诊断血清与预先溶化好的并保存于56℃水浴箱中保温的1.5%琼脂盐水按一定比例混合后，立即浇注在载玻片上，每块3.5ml（厚度2mm），置室温冷却凝固制成免疫琼脂板。

2、打孔：用直径3mm打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为15mm，孔内琼脂用打孔器的针尖挑出。

3、加样：取冻干参考血清一支，加入0.5ml蒸馏水溶解，用0.01mol/L  pH7.2~7.4PBS倍比稀释成1:10~1:160五种浓度。用微量加样器分别取10μl不同浓度的参考血清准确加入免疫板的孔内，每一浓度加2个孔，然后用同样的方法取10μl事先用PBS1:40稀释的待检血清加入孔内，每份标本加2个孔。

4、反应：将加样的琼脂板置湿盒内，放37℃恒温箱24—48小时后取出，测量各孔沉淀环直径并作记录。（图4—6）

【结果】

以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中IgG浓度为横坐标，在半对数纸上作图，绘制标准曲线。根据待检血清的沉淀环直径，从图上可查出IgG浓度。查得的浓度乘以标本的稀释倍数即可得该标本IgG的浓度（图4—7）

【注意事项】

1、  制备琼脂板时温度不宜太高以免抗体变性失活，也不宜太低以免使琼脂凝固不匀。

2、  制备琼脂板时，载玻片一定要置于水平位置。

3、  孔要圆整、光滑，孔中琼脂不能与载玻片分离。

4、    时间要适当。时间过短，沉淀线不能出现；时间过长，沉淀线解离或散开，影响结果判断。

5、  测量沉淀环直径必须准确，以mm为测量单位。

6、   

试验八、双向免疫扩散试验

（Double immunodiffusion test）

此法为定性试验。将抗原、抗体分别加入琼脂板相对应的小孔中，两者各自向四周扩散，在比例适当处形成可见的白色沉淀线。如果所加抗原、抗体标本中有多对抗原抗体系统，则因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成若干条沉淀线，一条沉淀线代表一对抗原抗体。因此观察沉淀线的位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。此试验常用于抗原和抗体的纯度鉴定，也可用已知的抗原（或抗体）检测未知的抗体（或抗原）。本试验以检测血清甲胎蛋白（AFP）为例。

【材料】

1、待检血清、AFP阳性血清。

2、AFP诊断血清。

3、1%琼脂盐水、载玻片、直径3mm打孔器、吸管等。

【方法】

1、琼脂板的制备：将载玻片置于水平台面上，用吸管吸取加热溶化的1%琼脂盐水3.5ml，均匀地浇注在载玻片上，注意勿产生气泡，琼脂厚度约为2mm。

2、打孔：待琼脂凝固后，用打孔器据图样（见图4-9）打孔，孔径3mm，孔间距5mm，挑出孔内琼脂。必要时将玻片底部在酒精灯火焰上略微加热，或在小孔内加入少量溶化的琼脂封闭孔底。

3、加样：用毛细细管于中央孔加入AFP诊断血清，周围1、4孔加入已知AFP阳性血清作为对照，2、3、5、6、孔分别加入待检血清。加样时以加满小孔为度，避免出现气泡和溢出孔外。

4、反应：将琼脂板放入湿盒内置37℃恒温箱中，24小时后取出观察结果。

【结果】

观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1、4两孔（AFP阳性血清）与中央孔（抗AFP抗体）之间应出现清晰的乳白色沉淀线。其余各孔则根据与中央孔之间有无沉淀线及沉淀线的特征判断结果。如图4-9所示，2、6孔待检血清标本与中央孔产生沉淀线，并与相邻阳性对照所产生的沉淀线相融合，则表示阳性；3孔无沉淀线出现，5孔虽形成沉淀线，但与阳性对照沉淀线相交叉，表明为另一对抗原抗体反应，故3、5孔均为阴性。

【注意事项】

1、加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形状。

2、反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性，时间过短，则沉淀线不出现或不清楚。

3、加样时抗体、阳性血清及每份待检标本应各用一支吸管，以免混淆，影响试验结果。

试验九、对流免疫电泳试验

（Counter immunoelectrophoresis test）

对流免疫电泳是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。将琼脂板置于电场中，在pH8.6的缓冲液中，大多数蛋白质抗原带负电荷向正极移动，而抗体为球蛋白，由于暴露的极性基团少，所带负电荷低，且分子量较大，移动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极移动（电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的液体带正电荷，因此液体向负极移动，产生电渗）。这样抗原抗体相向运动，在比例适当处形成乳白色沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，而使其定向移动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短了反应时间。此试验常用于检测甲胎蛋白（AFP）、乙肝病毒表面抗原（HBSAg）。

【材料】

1、HBSAg阳性血清、待检血清、抗HBSAg血清。

2、巴比妥钠—盐酸缓冲液（0.05mol/L，pH8.6）、1%离子琼脂（用缓冲液配置）。

3、载玻片、直径3mm打孔器、毛细吸管、电泳仪、滤纸片等。

【方法】

1、琼脂板的制备：将已制备好的离子琼脂在水浴中加热溶化，用吸管吸取3.5ml浇注在玻片上，冷凝后备用。

2、  用打孔器按模型打成双排孔，孔径3mm，孔间距4mm，行间距4mm。

3、加样：用毛细吸管在双排孔的一侧加入抗HBSAg血清，另一侧分别加入HBSAg阳性血清和待检血清，注意抗原抗体的位置要一致。加样时以加满小孔为度，注意不能让液体溢出。

4、电泳：将加好样的琼脂板放置电泳槽上，抗原孔置负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分别用双层滤纸片与电泳槽中的pH8.6的巴比妥钠缓冲液相连，接通电源，调节电流为2—4mA/cm板宽或电压为4—6V/cm板长，电泳45—60分钟。

5、电泳毕，关掉电源，取出琼脂板，观察在相应抗原抗体孔间有无白色沉淀线出现。

【结果】

阳性对照孔与抗血清孔间出现清晰白色沉淀线。若待检血清与抗血清孔间出现沉淀线为阳性，反之无沉淀线为阴性。若沉淀线不够清晰，可在37℃下放置数小时，以增强沉淀线清晰度。

【注意事项】

1、对流免疫电泳试验的灵敏度较双向免疫扩散试验高，但由于电泳时缓冲液的离子强度、pH值、端电压和电泳时间等因素的影响，有时可能出现假阳性反应。

2、抗原与抗体量应相接近，如抗原量过多，可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。

试验十、火箭免疫电泳试验

（Rocket immunoelectrophoresis）

火箭免疫电泳是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。将抗体溶入琼脂后制板，在琼脂板的一侧打孔，加入待检样品及不同浓度的标准抗原。电泳时抗原在含定量抗体的琼脂中向正极移动，并形成浓度梯度，在适宜的部位形成火箭状的沉淀峰。峰的高度与抗原浓度呈正相关。（见图4—11）当琼脂中的抗体浓度固定时，以不同浓度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待侧抗原的含量。反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待检抗体的含量（即反向火箭免疫电泳试验）。本试验以检测甲胎蛋白为例。

【材料】

1、甲胎蛋白诊断血清、待检血清、已知含量的甲胎蛋白标准溶液。

2、巴比妥缓冲液（0.025mol/L，pH8.6）、2%巴比妥琼脂、生理盐水。

3、电泳仪、5cm×9cm玻璃板、直径4mm打孔器、微量加样器等

【方法】

1、免疫琼脂板的制备：将甲胎蛋白诊断血清用巴比妥缓冲液稀释成1:100。取溶化并冷至56℃左右的2%巴比妥琼脂3.5ml与1:100稀释的甲胎蛋白诊断血清3.5ml混合，立即浇于5cm×9cm之洁净玻板上制成厚薄均匀的含抗体琼脂板。

2、打孔：琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板一端1cm处打一排小孔，孔径3mm，孔距5mm。

3、加样：用微量加样器分别准确吸取待检血清10μl加于孔内，同时将不同稀释度的甲胎蛋白标准液10μl加于另外几个孔内用于制作标准曲线。

4、电泳：将琼脂板放入电泳槽，样品孔靠近负极端，用双层滤纸与电泳槽相连。以电流强度为40mA进行电泳1~2小时，或端电压为3V/cm电泳6~8小时。

5、电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板。

6、将琼脂板放在生理盐水中漂洗1天，其间更换2~3次生理盐水以洗去未结合的抗原和抗体。从生理盐水中取出后，在琼脂板上滴加5%甘油以防止凝胶断裂，再取一条湿滤纸盖于琼脂板上，置37℃烘干，干后将滤纸打湿轻轻移去。

7、将琼脂板浸入0.05%氨基黑溶液中染色10分钟后取出，用5%醋酸脱色1小时，直到背景呈无色为止。脱色后，在琼脂板上滴少量5%甘油，放37℃温箱干燥后取出，分别量取各孔形成的沉淀峰的高度。

【结果】

以已知浓度的甲胎蛋白标准抗原形成的沉淀峰的高度作为纵坐标，以抗原浓度为横坐标绘制标准曲线。根据待侧血清沉淀峰的高度，从标准曲线中查出该血清中甲胎蛋白的含量。

【注意事项】

1、如采用高压电泳时（8~10V/cm），需配冷却装置。

2、待检样品多时为避免先加样孔抗原自由扩散造成电泳后出现孔周扩大的沉淀峰，可先将琼脂板放入电泳槽，在1V/cm电泳状态下加样。

3、正式试验前应作预试，调整好抗原、抗体的比例。

4、沉淀峰应呈圆锥状，如峰前端出现云雾状为过剩抗原引起的沉淀峰弥散。遇此情况，重复试验时可将样品适当稀释。

试验十一、免疫电泳试验

（Immunoelectrophoresis test）

免疫电泳是免疫扩散与电泳相结合的免疫学分析技术，具有极高的分辨力。主要用于抗原组成的定性分析。免疫电泳实际上分为两步：

1、电泳：将待检的可溶性物质在琼脂板上进行电泳分离，由于各种可溶性蛋白分子的颗粒大小、质量与所带电荷不同，在电场的作用下，其带电分子的运动速度（迁移率）具有一定规律，因此通过电泳能够把混合物中的各种不同成分分离开来。以血清为例（图4-12A），电泳后各种成分的位置是电泳速度与电渗速度的代数和。白蛋白分子量较小，所带负电荷较多，泳动最快，其次为α1、α2及β球蛋白，γ球蛋白泳动最慢。

2、琼脂扩散：当电泳完毕后，在琼脂板一端挖一条长的槽，加入相应抗血清，置湿盒内让其进行双向扩散。在琼脂板中抗原和抗体互相扩散，当两者相遇且比例适当时，可形成不溶性抗原抗体复合物，出现乳白色的特异性沉淀弧线（图4-12B、C）。

【材料】

1、巴比妥缓冲液（0.05mmol/L，pH8.6）。

2、1.2%离子琼脂（用巴比妥液配置）。

3、待检血清，纯化的人的IgG（1mg/ml），兔抗人血清。

4、载玻片、直径3mm打孔器、电泳仪、电泳槽、万用电表等。

【方法】

1、琼脂板的制备：将载玻片置于水平台上，用吸管吸取4ml事先已溶化好的1.2%离子琼脂浇注在载波片上，待其冷凝后按图4—13打孔。

2、加样：用微量加样器在上孔加待检血清15μl，下孔加纯化的IgG溶液15μl。

3、电泳：将已加样的琼脂板平放于电泳槽内，两端用2~3层纱布或滤纸搭桥，将靠近孔的一端连接负极，另一端连接正极，接通电源。通常按琼脂板长度电压4—6V/cm，电泳1~2.5小时。

4、扩散：电泳完毕后，取出琼脂板，按图4—13开槽，挑去长槽内琼脂，用已溶化的1.2%离子琼脂封底。在槽中加入兔抗人血清后将琼脂板置于湿盒内，于37℃恒温箱中进行双向免疫扩散，24小时或48小时后观察结果。

【结果】

观察并描记沉淀弧的数目、位置及形状，参照免疫球蛋白迁移范围示意图（图4—14），识别主要Ig。

【注意事项】

1、挖槽时要注意平行整齐，加入抗体不要外溢。

2、有时抗原抗体反应形成的沉淀线很弱，肉眼不易观察，可用氨基黑染色液染色。

3、染色标本应在白色背景下观察，不染色标本需在斜射光的暗色背景下观察。

4、对分子量过小的抗原（如游离Ig轻链）要随时观察结果。

【思考题】

1、试分析双向琼脂扩散中沉淀线的位置及形状与抗原、抗体的浓度及扩散速度的关系。

2、试分析双向琼脂扩散试验、对流免疫电泳试验、免疫电泳试验的优缺点。

补体参与的反应

内容：

实验十二、补体结合试验

实验十三、总补体活性测定

补体（complement）是存在于正常人和脊椎动物血清及组织液中一组具有酶原活性的蛋白质。当它们被某些物质激活后，即可发生连锁的酶促反应，表现出各种生物学活性。

利用补体激活后的各种生物学功能（如溶细胞及免疫粘附等），可进行有关实验，涉及补体的实验方法大致分为两类：一类是有补体参与，用已知抗体（或抗原）检测相应抗原（或抗体）的实验。另一类是直接对补体活性和各组分含量的检测。下面主要介绍补体结合试验及血清总补体活性测定。

实验十二、补体结合试验

（Complement fixation test，CFT）

补体结合试验是利用抗原抗体复合物可与补体结合，而单独的抗原或抗体不能结合补体的特点，以溶血系统为指示剂，用已知抗原（或抗体）来检测未知抗体（或抗原）。此试验中有5个成分参与，分属于2个系统：

第一系统为反应系统：抗原+抗体+补体。如果抗原与抗体相对应，则能特异性结合并固定补体；否则，补体不被结合，仍游离于溶液中。

第二系统为指示系统：绵羊红细胞+溶血素。作为第一系统抗原与抗体是否对应的指示剂，如第一系统中抗原与抗体特异性结合，固定了补体，则再加入羊红细胞与溶血素时，由于缺乏补体，不会发生溶血反应，此为CFT阳性。若抗原抗体不对应，则补体不被结合，仍游离于溶液中，而被随后加入的羊红细胞与溶血素复合物固定，并被激活，导致红细胞溶解，此为CFT阴性（如图     ）。

图     补体结合实验示意图

本试验敏感性和特异性均较高，可用于检测某些病毒病、立克次体病、梅毒病等。

【材料】

⒈ PH7.4巴比妥缓冲液。

⒉ 补体：豚鼠新鲜血清2u单位。

⒊ 绵羊红细胞：用缓冲液洗涤3次，配成2%悬液。

⒋ 抗原（2u）：可购商品，按说明稀释至使用效价。如自制，则需用阳性抗血清滴定其效价。

⒌ 待检血清和阳性血清：56℃灭活30min，1：50稀释。

⒍ 溶血素（2u）。

⒎ 生理盐水、小试管、刻度吸管、恒温水浴箱。

【方法】

⒈ 取试管5支，标明顺序（表     ）。

⒉ 按表     依次加入病人血清、抗原、补体、生理盐水摇匀。

⒊ 放37℃水浴箱中30min。

⒋ 取出加入溶血素和羊红细胞，摇匀。

⒌ 再放入37℃水浴箱中水浴30min，取出观察结果。

表       补体结合试验（单位：ml）

【结果】

⒈ 管内液体混浊呈浅红色为不溶血。

⒉ 管内液体透明呈红色为溶血。

⒊ 第2、3、4管为对照管均应溶血，第5管为羊血细胞对照不应溶血。凡第1管红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性，而不溶血者为阳性。

【注意事项】

⒈ 为了防止产生抗补体，要求血清和其他液体标本，以及所用的诊断抗原、抗体，均不能被细菌污染。血标本应立即分离血清，及时操作或冰冻保存。

⒉ 除补体外，各种血清均需56℃，30min灭活。

⒊ 所有的试管、吸管等玻璃仪器必须十分洁净。

⒋ 由于试验中各成分量之间必须有适当比例，才能避免结果的假阳性或假阴性，因此除绵羊红细胞浓度固定外，其他成分如溶血素、补体、抗原或抗体均需事先滴定其单位，配制成规定浓度，以保证结果的可靠性。

附：

⒈ 溶血素单位滴定：

先用缓冲液将溶血素稀释成不同浓度，再将不同浓度溶血素按表     滴定后取出观察，以出现100%溶血的最高溶血素稀释度为1U。如表     结果所示，1：4000的溶血素（0.1ml）为1U，正式试验用2U，即1：2000的溶血素（0.1ml）。

表       溶血素滴定

⒉ 补体单位滴定：

按表     操作后取出观察，以出现100%溶血的最小补体量为1U。如表3所示，1：30的补体0.12ml为1U，2U则为1：30补体0.24ml。正式试验要求补体0.2ml中含2U，其计算方法如下：0.24：0.20=30：X；X=（0.20/0.24）×30=25。故将补体原液1：25稀释后，每0.2ml即含有2个U。

⒊ 抗原滴定：

①  将抗原和阳性抗血清分别用缓冲液作倍比稀释，使成为1：2、1：4……1:256。

②   按表3所列抗原抗体的稀释度，每管加入抗原0.1ml、抗体0.1ml，对照管只加一种，用缓冲液替代另一种。

③   每管加入2U补体0.2ml，混匀，置37℃水浴60min，或置4℃冰箱过夜。

④   每管加入2%绵羊红细胞0.1ml及2U溶血素0.1ml，混匀，37℃水浴30min。

⑤   取出观察，以出现100%不溶血的抗原与抗体的最适稀释度作为抗原的最适浓度。如表4所示，1：64抗原管及1：32抗血清管各作为1U。正式试验时，抗原采用2-4U（1：16-1：32），抗体采用4U（1：8）。

表       补体滴定

表       抗原抗体滴定结果示例

实验十三、总补体活性测定（CH50单位测定）

（Total complement activity determination）

利用绵羊红细胞与相应抗体（溶血素）结合成的复合物，可激活血清中的补体，导致红细胞溶解，当红细胞和溶血素量一定时，在规定的时间内，溶血程度与补体量及活性呈正相关。总补体测定现在多采用50%溶血活力（complement hemolysis 50%,CH50%）测定，这是因为溶血程度在30-70%的范围内补体的含量稍有变动即能影响溶血程度，当50%溶血时，其溶血程度与补体含量关系最敏感，故以50%溶血作为判定终点。以引起50%溶血所需的最小补体量为一个CH50U，可计算出待测血清中总的补体溶血活性，以CH50U/ml表示。人血清总补体正常值为50～100CH50U/ml。

图     补体滴定曲线

【材料】

⒈ PH7.4巴比妥缓冲液。

⒉ 2%绵羊红细胞（将脱纤维绵羊红细胞用缓冲液离心洗涤3次，末次用2000r/min离心10min，取压积红细胞用缓冲液配成2%。）

⒊ 溶血素：可购商品，按说明稀释至使用效价。如自制，则需先滴定其效价，然后再稀释至2U（溶血素滴定方法见“补体结合试验”）。

⒋ 待检血清。

⒌ 试管、吸管、水浴箱等。

【方法】

⒈ 致敏绵羊红细胞：2%绵羊红细胞加等量2U溶血素，混匀，置37℃水浴15min。

⒉ 稀释血清：待检血清0.2ml，加缓冲液3.8ml，稀释度为1：20。

⒊ 配制溶血标准管：2%绵羊红细胞2ml加蒸馏水8ml，混匀，即为全溶血管。取全溶血管液2ml加缓冲液2ml，即为50%溶血标准管。

⒋ 按表     依次加各成分于试管中，混匀，置37℃水浴30min。第10管为不溶血对照管。

⒌ 取出试管，2000r/min离心10min，与50%溶血标准管比较，判定结果。

表     补体总活性测定

【结果】

肉眼比色，取溶血程度与标准管最接近的待检血清最高稀释管作为总补体含量计算管。计算公式如下： CH50%（U/ml）=×稀释倍数

如第5管为终点管，测待检血清中CH50%=×20=66.7(U/ml)。

【注意事项】

⒈ 待检血清要求新鲜，稀释血清时要求准确。

⒉ 配制标准溶血管的绵羊红细胞应与本次用的绵羊红细胞为同一批。

⒊ 每批溶血素用时都应滴定效价。

⒋ 所用的玻璃器皿一定要清洁。

附：PH7.4巴比妥缓冲液配制

①  贮存液

巴比妥5.75g、巴比妥钠3.75g、NaCl85.00g、MgCl2·6H2O1.02g、CaCl20.17g。

上述成分逐一加入热蒸馏水中，溶解后补加蒸馏水至2000ml，过滤，4℃冰箱保存。

②  应用液

1份贮存液加4份蒸馏水配制而成。12小时内使用。

                                  免疫标记技术

内容：

实验十四、免疫荧光技术

实验十五、流式细胞术

实验十六、酶联免疫吸附实验

实验十七、放射免疫测定法

免疫标记技术（immunolabelling techniques）是指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为示踪物，标记抗体或抗原，然后进行抗原抗体反应；并籍助于显微镜、射线测量仪、酶标测量仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定的一项免疫学实验技术。由于被标记的抗原或抗体仍具有与相应的抗体或抗原结合的特性，同时又具有了标记物的高敏感性，故免疫标记技术具有特异、敏感、快速、能定性、定量、定位，且易于观察等优点。

实验十四、 免疫荧光技术

（Immunofluorescence technique）

免疫荧光技术又称荧光抗体技术。始创于40年代初，它是把免疫学的特异性与荧光素显示的敏感性同显微镜的精确性有机地结合起来的一项检测技术。

荧光素是一种染料，在紫外线或蓝光照射下，被激发出波长较长的荧光。某些荧光素在一定条件下，可与抗体分子结合，但不影响抗体与抗原结合的性能。用该荧光抗体将标本染色后，在荧光显微镜下加以观察，可对待检标本中相应抗原进行鉴定和定位。目前最常用的有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocynate，FITC），罗丹明（lissasmine rhodamine B200，RB200）等。其中FITC使用最广泛，它的最大吸收光谱为490-495nm，最大发射光谱为520-530nm，呈黄绿色荧光。

用于临床检验的荧光抗体试验主要有直接法、间接法、补体结合法。

1． 直接免疫荧光法：是将荧光素标记在针对某抗原的特异性抗体上，直接检测该抗原。此法操作简单，可用于检测细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白抗原。其缺点是只能检查一种相应抗原，实际工作中很不方便故很少应用。

图     直接免疫荧光法

⒉ 间接免疫荧光法：是将荧光素标记在第二抗体上，然后与抗原抗体复合物反应。可用于检测未知抗原，也可用于检测未知抗体。此法只需制备一种荧光抗体就可以检出多种抗原，可用于不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的检测，以及自身抗体和感染病人血清抗体的检测。间接法比直接法敏感性高，但较易产生非特异性染色。

图     间接免疫荧光法

⒊ 补体结合法：是将荧光素标记在抗补体抗体上，然后与抗原-抗体-补体复合物反应。可用于检测未知抗原或抗体。此法荧光抗体不受免疫血清动物种属的限制，一种荧光抗体可作更广泛应用。对检查形态小的如立克次体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质甚为理想。补体结合法敏感性更高，但更易产生非特异性染色。

图     补体结合法

下面以抗核抗体（antinuclear antibody，ANA），即真核细胞核成分为靶抗原的自身抗体检测为例，着重介绍间接免疫荧光法（该抗原和抗体无器官及种属特异性）。

【材料】

⒈ 大白鼠。

⒉ 兔抗人免疫球蛋白荧光抗体（商品化试剂）。

⒊ 正常人血清、SLE阳性血清、待检血清。

⒋ 0.01mol/L，PH7.0磷酸盐缓冲盐水（PBS）。

⒌ 恒温孵箱、载玻片、有盖湿盒、烧杯、荧光显微镜。

⒍ 缓冲甘油（1份甘油，1份PBS）。

【方法】

⒈ 制备抗原片：将大白鼠断颈，放血，剖腹取肝脏，并将肝脏剪成8mm×5mm的组织块，用吸水纸吸干渗出的浆液后，压印于洁净的载玻片上，使留下一薄层肝组织细胞。将肝组织印片凉干后置4℃冰箱冷藏1周备用。

⒉ 取肝印片，编号，分别滴加正常血清、SLE阳性血清、待检血清、PBS后置湿盒，37℃孵育30min。

⒊ 用PBS冲洗2-3次，冷风吹干。

⒋ 滴加荧光抗体，置湿盒37℃孵育30min。

⒌ 用PBS冲洗2-3次，冷风吹干，滴加缓冲甘油1滴，覆以盖片后，在荧光显微镜下观察。

【结果】

先置低倍镜观察，阳性者，可见有大小一致边界清楚的绿色荧光。可疑者再以高倍镜进一步观察。

【注意事项】

⒈ 温育时一定要将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。

⒉ 注意与非特异性荧光鉴别，后者往往较大，形态不一，边界不清。

⒊ 每次试验还应设PBS对照（鼠肝印片+PBS），以排除非特异性荧光。

附：0.01mol/L PBS(PH7.0)：

A液（0.2mol/L）：NaH2PO4·H2O 27.6g，加蒸馏水至1000ml

B液（0.2mol/L）：Na2HPO4·12H2O 71.6g，加蒸馏水至1000ml

A液16.5ml，B液33.5ml，NaCl 8.5g，加蒸馏水至1000ml。

实验十五、流式细胞术

（Flow cytometry，FCM）

流式细胞术是一种通过流式细胞仪—又称荧光激活细胞分离器（fluorescene activated cell sorter，FACS）在液流系统中对单个细胞表面分子、细胞亚群、胞内信号传递以及细胞周期等进行快速、准确鉴定的新技术。其基本原理是将单个细胞经荧光抗体染色后，用FACS把细胞高速流动系统的机械颤动喷嘴喷出的细胞形成单行，一个一个的通过检测区，经单色激光照射后发出的荧光信号及散射光信号，由荧光检测计及散射光检测器进行检测，并进一步转变成电信号，由电脑分析记录。同时，由于带电滴流所带的电荷量不同，其在偏转电极作用下可发生不同程度的偏转，因此还可以进行细胞的分选（如图      ）。

图      流式细胞仪原理示意图

【材料】

⒈ 肝素。

⒉ Hank＇s液、红细胞裂解液（Tris-NH4Cl缓冲液）、0.01mol/L PBS(PH7.0)。

⒊ 抗CD4、CD8单抗。

⒋ 荧光标记羊抗鼠IgG抗体。

⒌ 淋巴细胞分离液。

⒍ 待检细胞。

⒎ 流式细胞仪。

⒏ 离心管、离心机、恒温孵箱、毛细吸管、尼龙网等。

【方法】

⒈ 肝素抗凝血4ml，加等量Hank＇s液稀释。

⒉ 各取4ml稀释血，分别置于2支盛有4ml淋巴细胞分离液的离心管中，离心2000rpm，20min。

⒊ 离心后的血液分为4层，从上至下分别为血浆、单个核细胞（主要为淋巴细胞）、粒细胞和红细胞。用毛细吸管吸取单个核细胞于另一离心管中，并加入Hank＇s液洗涤1次，离心1000rpm，10min，去上清液。

⒋ 加入红细胞裂解液，置37℃，5min，离心1000rpm，10min，去上清液。

⒌ Hank＇s液洗涤1次（同上），细胞用PBS调成1×106个/ml，1ml/管分装。

⒍ 取上述细胞，分别加入CD4、CD8单抗和荧光标记羊抗鼠IgG抗体各100ul，置4℃，30min（避光）。

⒎ Hank＇s液洗涤2次（同上面），离心2000rpm，10min。

⒏ 30～40μm尼龙网过滤后，用流式细胞仪处理。

【结果】

在荧光直方图上分别计算出CD4、CD8阳性细胞峰的百分率（如图     ）。图上每1点代表1个细胞，每个点与纵坐标的距离即表示该点的相对CD8值，与横坐标的距离即表示该点的相对CD4值。

图    

【注意事项】

⒈ 样品必须是单细胞悬液，不能有团块和细胞粘连，细胞浓度以1×106个/ml为宜。

⒉ 应尽量减少细胞碎片，否则影响结果。

⒊ 将血液加入淋巴细胞分离液时应沿管壁缓慢加入，以免造成血液与分离液混合。

⒋ 操作过程应低温，避光。

实验十六、酶联免疫吸附实验

（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是固相吸附技术和免疫酶标记技术相结合的一种方法，它是目前应用最广泛的检测技术。它利用了免疫反应（即抗原-抗体反应）的高度特异性和酶促反应的高度敏感性（可达ng水平），进行对抗原或抗体的检测，是一种定性和定量的综合性技术。

抗原或抗体吸附到固相载体表面，仍保持原有免疫活性。而酶标抗体或抗原中，酶活性与免疫活性互不影响，且酶标记物中的酶催化底物显色，显色的深浅与相应抗原或抗体含量成正比，因此可用酶标仪作定量检测。

检测方法有三种：

间接法—常用于抗体检测；双抗体夹心法—常用于抗原检测；竞争抑制法—既可用于抗原检测，也可用于抗体检测

下面以早孕孕妇尿HCG检测为例介绍双抗体夹心法：

【材料】

⒈ 包被了抗-HCG的酶标反应杯、酶标抗-HCG、洗涤液、底物、显色液（商品化试剂）。

⒉ 待检尿样。

⒊ 烧杯、蒸馏水、毛细吸管、吸水纸等。

【方法】

⒈ 用毛细吸管向反应杯内加待检尿样1滴，再加酶标抗-HCG1滴，室温反应2min。

图      三种ELISA方法原理示意图

⒉ 杯内先加洗涤液1滴，并用蒸馏水加满反应杯后洗涤，倒掉液体并甩干，继后仅用蒸馏水加满反应杯洗涤5次，用吸水纸拍干杯内液体。

⒊ 加底物1滴。

⒋ 加显色剂1滴，室温反应2min。

【结果】

杯内液体无色为阴性、蓝色为阳性。可用酶标仪检测尿中HCG的含量。

【注意事项】

⒈冰箱中保存的商品化试剂取出恢复至室温后再使用。

⒉洗涤要彻底，防止出现假阳性。

⒊各试剂的小盖不要戴错，否则可造成假阳性。

实验十七、放射免疫测定法

（Radioimmunoassay，RIA）

放射免疫测定技术，是将抗原抗体反应的特异性和放射性同位素分析的高敏感性相结合，通过一些特殊仪器进行超微量、定性分析的一项技术。其灵敏度可达ng甚至pg水平。在临床检验中常用于测定微量蛋白质、激素和药物等。

标记的同位素能分别发射γ射线和β射线。前者如125I、131I，后者如3H、32P等。因此，进行放射性免疫测定的仪器有两类：一种为晶体闪烁计数仪，测γ射线；另一种为液体闪烁计数仪，测β射线。

根据操作方法的不同，可分为液相法和固相法：

（一）固相法

与固相酶免疫技术相似，本法是将抗原或抗体吸附到固相载体表面（常用的固相载体有溴化氰活化纸片或聚苯乙烯小珠），加入待检标本（相应抗体或抗原），最后加入放射性标记的抗Ig抗体，测定固相载体上复合物的放射性。下面以放射过敏原吸附试验（radio allergen sorbent test，RAST）为例介绍：

【材料】

⒈ 特异过敏原偶联纸片（商品化试剂）。

⒉ 洗涤液：生理盐水+0.1%Tween-20。

⒊ 塑料试管、试管架。

⒋ 待检血清。

⒌ 125I-抗人IgE（商品化试剂）。

⒍ 晶体闪烁仪。

【方法】

⒈ 取数支5ml塑料试管置于试管架上。

⒉ 除2支对照管外，其余各管分别加一张过敏原偶联纸片。对照管用于测定总放射活性T。

⒊ 吸取1：10待检血清100ul，加入各实验管内，一式两份。

⒋ 室温反应3小时后用洗涤液3次，每次10min（对照管除外）。

⒌ 每管加100ul125I-抗人IgE，室温过夜。

⒍ 用洗涤液洗3次（对照管除外）。

⒎ 晶体闪烁仪测每管放射活性（cpm）。

【结果】

结合率=待检样品管放射活性（B，cpm）/总放射活性（T，cpm）

与标准品及阴性对照管结合率比较，判断阴阳性。

【注意事项】

⒈ 放射性污染。

⒉ 每个标本应做两管，取平均值，以减少误差。

（二）液相法

用同位素标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争结合反应。

因标记抗原与特异性抗体的量是固定的，故标记抗原抗体复合物形成的量随非标记抗原量的多少而改变。如非标记抗原量增加，则标记抗原抗体复合物就减少，而游离的标记抗原相应增加，即受检标本中抗原浓度与抗原抗体复合物的放射性强度成负相关。下面以血清皮质醇测定为例介绍。

【材料】

⒈ 125I标记的皮质醇抗原（Ag*），标准品浓度分别为0，1，5，10，25，50ug/dl。

⒉ 抗皮质醇抗体（Ab1）。

⒊ 抗-抗皮质醇抗体（Ab2）。

⒋ 小试管、移液器、离心机、晶体闪烁计数仪等。

⒌ 待检病人血清（待检Ag）。

【方法】

⒈ 取小试管数支，编号，按下表操作。

 表     皮质醇放射免疫测定法

⒉ 各管在晶体闪烁计数仪上测定沉淀物放射强度（cpm）。

【结果】

⒈ 按公式计算各标准管及病人标本B/B0%

B/B0%=×100%

⒉ 以各标准管B/B0%为纵坐标，标准浓度为横坐标，绘制标准曲线。

⒊ 在标准曲线上查出待检标本的未知浓度。正常值：3.5—20ug/dl成人。

【注意事项】

⒈ 第10管为非特异性管、第3管为零标准管、第4～10管为标准管或待检管。第二管为T管，用于测定最大结合率。

⒉ 病人血清应保存于2-8℃，严重溶血者不能用。

⒊ 弃上清时应尽量使上清全部弃去，不残留可见小滴。

⒋ 注意放射污染。

【思考题】

1．在总补体活性测定中，为什么选用CH50%作为溶血判定终点？

2．试述补体结合试验正式试验中各对照管的意义。

3．常用的免疫荧光染色法各有何优缺点？

4．流式细胞术有何实用意义？

5．常用的ELISA方法有哪些？

6．放射免疫测定法有何优缺点？

免疫细胞的检测

内容

实验十八、外周血单个核细胞的分离与纯化

试验十九、E玫瑰花结试验

试验二十、溶血空斑试验

试验十八、外周血单个核细胞的分离与纯化—密度梯度离心法

（isolation and purification of peripheral blood mononuclear cell）

人体外周血单个核细胞（主要包括淋巴细胞和单核细胞）与血液中的其它成分存在密度差异，红细胞与中性粒细胞的比重是1.092，单个核细胞约为1.075~1.090，血小板约为1.032。市售的淋巴细胞分层液的比重为1.077±0.002g/L，与单个核细胞比重相近。通过离心后，各种血液成分将按其密度梯度重新分布聚集，从而将单个核细胞与其他血细胞分离。

[材料]

1．      淋巴细胞分层液（Ficoll-Hypaque，比重为1.077±0.002g/L）、 肝素溶液（200U/ml）、无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液，2%的台盼蓝染液。

2．      离心管、毛细吸管、水平离心机、注射器等。

[方法]

1．      无菌采集人静脉血2ml，用肝素溶液抗凝（每1ml 全血加20U肝素），加Hank’s液2ml作等倍稀释。

2．      用毛细吸管将稀释的抗凝血沿管壁轻缓地加入盛有2~3ml淋巴细胞分层液的离心管中，使血液重叠于分层液上，两者间保持界面清晰。

3．      将加好血液的离心管置水平离心机，2000rpm离心20min后，小心取出。离心后的血液成分分布如图   。

                  图   密度梯度离心法分离前后血细胞分层示意图

4．      将毛细吸管轻轻插入，吸出白色云雾状的单个核细胞层；或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板后，再用另一支毛细吸管仔细吸出单个核细胞层，用5倍体积的Hank’s液洗涤3次，每次1500rpm，离心10min。

5．      细胞计数：将洗涤后的细胞加0.5ml的完全RPMI-1640培养基（含10%灭活的小牛血清）制成细胞悬液。取0.1ml细胞悬液与2%冰醋酸等量混合，用血球计数板按白细胞计数法计数，并按下式计算出4个大方格内的细胞数：

细胞数（/ml）= 4个大方格细胞数×104×稀释倍数

4

6．      细胞活力检查：取2滴细胞悬液与1滴2%台盼蓝染液混匀，5min后在高倍镜下观察，活细胞不着色，死细胞染成蓝色，计算活细胞百分率。

[注意事项]

1．      操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。

2．      将稀释血加入分层液上时，动作一定要轻缓，切不可冲散分层液而使血液与之混合，以免影响分离效果。

3．      此法分离所得的细胞悬液中含有少数单核细胞，利用单核细胞对玻璃具有粘附力的特点，可用以下粘附去除法去除：

（1）           玻璃平皿吸附法：将单个核细胞悬液倒入玻璃平皿中，置37℃温育30min，单核细胞便粘附在平皿上。吸出未粘附细胞，即可获得大于95%的淋巴细胞。

（2）           玻璃纤维柱法：将单个核细胞悬液倒入装有玻璃纤维的柱层中，置37℃温育45min，用预温的37℃的Hank’s液冲洗，收集洗脱细胞，即主要为淋巴细胞。

实验十九、E玫瑰花结试验

（erythrocyte  rosette  test）

   人体T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（sheep  red  blood  cell，SRBC）受体，它是T细胞的特异性标志。在体外一定条件下，将T细胞与SRBC混合，SRBC能结合于T细胞周围，形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的玫瑰花样的花结，称为E玫瑰花结。本试验可用于计数T细胞，了解机体的细胞免疫状态；也可将SRBC用溴化二氨基异硫氢化物（AET）处理后与T细胞形成大花结，再经淋巴细胞分层液离心花结形成细胞，并经低渗溶液溶解其中的SRBC而分离T淋巴细胞。

E玫瑰花结试验分为总E（Et）花结试验和活性E（Ea）花结试验。前者检测的是标本中T淋巴细胞的总数，而后者检测的是对SRBC具有高度亲和力的那部分T淋巴细胞。Ea花结试验更能敏感反映机体的细胞免疫功能。

根据所需血量的多少，E玫瑰花结试验分为常量法和微量法。以下介绍常量法。

[材料]

1．   淋巴细胞分层液（比重为1.077±0.002g/L）、Hank＇s（无Ca2+ 、Mg2+）、Alsever溶液。

2．   SRBC悬液：自绵羊颈静脉无菌采血，放入盛有玻璃珠的无菌三角烧瓶，摇动数分钟，使之脱纤维。每10ml血加5mlAlsever溶液混合，置4℃冰箱备用。

3．   吸收灭活的小牛血清：小牛血清置56℃水浴30min灭活。取2体积灭活的小牛血清，加1体积压积的SRBC，混匀后置37℃温育30min，离心沉淀SRBC，吸取上清液放4℃冰箱备用。

4．  瑞氏染液、0.8%戊二醛。

5．  离心机、毛细吸管、载玻片等。

[方法]

1．   无菌采集人静脉血1ml，肝素溶液抗凝，用Hank’s液等倍稀释，经密度梯度离心分离淋巴细胞，用含20%小牛血清的Hank＇s液将细胞调整为2×106/ml的浓度。

2．   将Alsever液保存的SRBC吸去上清，然后吸取0.02ml的沉淀细胞，用Hank’s液洗涤3次，每次1500rpm离心10min，将压积的SRBC用Hank’s液配成浓度约为8×107个/ml的1%SRBC悬液。

3．  按以下流程图进行操作：

4．取出后吸去部分上清液，轻轻摇匀，加0.8%戊二醛2滴，固定15分钟。然后取1滴液体涂片，自然干燥后作瑞氏染色，油镜或高倍镜下观察结果。

[结果]

凡1个淋巴细胞周围吸附3个或3个以上SRBC者，为E花结形成细胞。计数200个淋巴细胞，计算Et和Ea花结形成细胞的百分率。

E玫瑰花结形成率（%）=形成E花结细胞数×100

                             200

正常值一般为：Et是60%~80%，Ea为25%~40%。

[注意事项]

1．      用Alsever溶液保存的SRBC在2周以内可以使用。

2．      检测的血液标本要新鲜，放置时间不超过3~4h，分离的淋巴细胞用台盼蓝染色法计数，活细胞率不能低于95%。

3．      重悬花环时，只宜轻缓旋转试管，使细胞团块散开即可，不能强力吹打，否则花环会减少或消失。

实验二十、溶血空斑试验—琼脂溶血空斑技术

（hemolysis plaque test）

   溶血空斑试验是体外检测抗体产生细胞（B细胞）的一种方法。其基本原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC混合，在补体的参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体产生细胞周围形成一个肉眼可见的溶血空斑。

   本试验主要分为琼脂溶血空斑技术和液相单层溶血空斑技术，每一类又可分为直接法和间接法两种。以下介绍琼脂溶血空斑技术。该技术是以一定浓度的琼脂为支持物，将一定浓度的SRBC和经SRBC免疫过的小鼠脾细胞悬液在45℃下混匀，倾注平皿，然后加入一定量的补体，经37℃温育后，在琼脂平皿中观察溶血空斑。

[材料]

1．  玻璃平皿（5.5×1.5cm）、剪刀、镊子、青霉素小瓶、水浴箱等。

2．  1８～2５g小白鼠。

3．   pH7.2的Hank＇s（含Ca2+ 、Mg2+ ）、SRBC悬液、1%DEAE-右旋糖酐、补体（1∶30）。

4．  １.4%琼脂5ml、0.7%琼脂1.5ml。

［方法］

１．免疫脾细胞的制备

（１）   免疫小白鼠：每只小白鼠经尾静脉注入2×109 /ml的SRBC悬液0.2ml，或腹腔注射4×108 /ml的SRBC 悬液1ml。

（２）   制备脾细胞悬液：将免疫4天后的小白鼠断颈处死，解剖取出脾脏，放入冷Hank＇s液中漂洗，然后置无菌青霉素小瓶内，用剪刀剪碎，加入适量的Hank＇s液，用毛细吸管吹打，使细胞分散成悬液，静置3min。待大块组织下沉后，取上层液体移至小试管中，1500rpm离心5min，弃上清，加入3ml 的Hank＇s液，吹打混匀，调整细胞浓度为1×107 /ml，放4℃冰箱备用。

2． 底层琼脂的制备：将１.4%的琼脂5ml加热溶化后，倾注到置水平位的平皿内，将平皿反扣，放37℃温箱1h后使用。

3． 顶层琼脂的制备：将0.7%的琼脂1.5ml加热溶化后，置于45℃水浴箱中，依次加入1%DEAE-右旋糖酐0.05ml，2×109 /ml 的SRBC悬液0.1ml，1×107 /ml的脾细胞悬液0.1ml，迅速将上述小试管中的各成分在水浴中振荡混匀，立即倾入已铺好底层琼脂的平皿中，于水平位轻轻旋转平皿，使之均匀平铺，凝固后，放37℃温箱1h。

4．  加补体：取出平皿，加入1∶30的新鲜豚鼠血清1.5ml，继续放37℃温箱30min，取出后室温下放1h，再放4℃冰箱过夜，次日倒去补体，进行空斑计数。

[结果]

将平皿划分小方格，用放大镜观察并计数溶血空斑总数，再换算出每百万脾细胞中所含的抗体形成细胞数。如用于药物的筛选，可比较给药组和对照组每百万脾细胞中抗体形成细胞的平均值，以表示药物的刺激作用或抑制作用。

 [思考题]

1.       为什么Ea试验比Et试验更能准确地反映机体的细胞免疫状况？

2.       溶血空斑形成的原理是什么？

变态反应（Allergy）

【内容】

实验二十一、动物过敏试验

实验二十二、肥大细胞脱颗粒试验

变态反应，又称超敏反应（Hypersensitivity），是免疫机体再次接触相同变应原时发生的反应过度剧烈而导致生理功能紊乱或组织损伤的病理性免疫反应。是临床上的常见病及多发病，发病率为10%~20%。检测变态反应的实验方法有多种，下面主要介绍动物过敏试验及肥大细胞脱颗粒试验。

试验二十一、动物过敏试验

（allergization  test  of  guineapig）

豚鼠过敏试验属Ⅰ型变态反应，与人类的青霉素和异种血清蛋白引起的过敏性休克相似，通过了解动物实验性过敏性休克的方法及结果观察，有助于加深和理解Ⅰ型超敏反应的主要特点，发病机制及临床表现。其基本原理是先给豚鼠注射异种蛋白，经过一段时间，动物产生IgE等亲细胞型抗体，吸附于体内组织中的肥大细胞及血液中的嗜硷性粒细胞，使机体对该变应原（异种蛋白）处于致敏状态。当第二次给处于致敏状态的动物注射相同变应原时，变应原与肥大细胞和嗜硷性粒细胞表面的IgE结合，引起肥大细胞和嗜硷性粒细胞膜构型改变，细胞脱颗粒，释放多种活性介质，作用于相应效应器官，引起各种过敏症及过敏性休克。

【材料】

1、动物：体重150克左右的幼小豚鼠3只。

2、变应原：人血清、鸡蛋白。

3、注射器、针头、酒精棉球

【方法】

1、致敏注射：取健康豚鼠3只，分别编为1号、2号、3号。

①于1号豚鼠腹腔注射1:10卵白蛋白1ml。

②2号豚鼠腹腔注射1:8人血清1ml。

③3号豚鼠不注射。

2、发敏注射：经14~21天致敏后，3只豚鼠分别同时心内注射1:10稀释卵白蛋白1-2ml，观察各豚鼠行为表现有何差异。

【结果】

1、1号豚鼠很快出现烦燥不安，耸毛、抓鼻、打喷嚏、痉挛性跳跃、大小便失禁等症状，重者数分钟内由于呼吸肌痉挛窒息而死亡。

2、2号和3号豚鼠无任何症状发生。

试验二十二、肥大细胞脱颗粒试验

（degranulation  test  of  mastocyte）

肥大细胞脱颗粒试验是一种体外测定速发型变态反应的方法。本试验既可用已知抗原检测病人是否存在有相应的IgE，也可用过敏反应的病人血清寻找相应的过敏原和选择用药。其实验结果与皮肤反应及临床过程相一致。其基本原理是肥大细胞受到IgE、促分泌剂（如过敏毒素、C3a、C5a、P物质）或低氧、冷热、阳光等刺激以后，均能引起脱颗粒。亲细胞抗体IgE可通过Fc受体吸附于肥大细胞表面，当与相应抗原结合后，使IgE的Fc段变构，促使肥大细胞膜改变，导致细胞内发生一系列变化，使肥大细胞内嗜硷性颗粒脱出，并释放活性介质作用于效应器官，引起一系列临床症状。

【材料】

1、大白鼠血清的制备　取体重200g左右的健康雄性大白鼠一只，麻醉后心脏采血，分离血清备用。

2、大白鼠肥大细胞的制备　取上述大白鼠腹腔注射pH7.2的Hanks液15~20ml（含EDTA，浓度0.5mg/ml）。轻揉腹部1分钟后，于腹部作一小切口，用毛细吸管吸出腹腔液，离心3000rpm15分钟。弃上清，管底细胞用含有上述大白鼠血清的营养液洗涤一次（6ml  Hanks液加2ml大白鼠自身血清），弃上清，将管底细胞悬浮于1ml含有大白鼠自身血清的Hanks液中备用（细胞应置于冰浴中）。

3、肥大细胞的鉴定　取细胞悬液1滴加于载玻片上，并盖上涂有中性红的盖片，在高倍镜下观察100个细胞。正常肥大细胞为正圆形、边缘光滑，细胞浆内含有分布均匀的颗粒。如果细胞肿胀，细胞边缘不整齐，颗粒自细胞内流出，说明该细胞自身脱颗粒。若超过30%者，不宜用于正式试验。

[方法]

1、取上述肥大细胞悬液1滴置于载玻片上，加被检病人血清1滴，混匀后放37℃静置5分钟，使血清中IgE吸附于肥大细胞表面。

2、取出玻片，加相应抗原1滴，混匀，置37℃5~10分钟。

3、取出载玻片，盖上涂有中性红染液的盖片，高倍镜观察。

4、对照试验

（1）抗原对照：细胞悬液1滴加抗原1滴混匀。

（2）血清对照：细胞悬液1滴加病人血清1滴混匀。

将上述两种对照置37℃5~10分钟，同正式试验一样，盖上涂有中性红染液的盖片，显微镜检查，通常应没有脱颗粒现象。

【结果】

1、脱颗粒细胞：细胞肿胀，边缘不整齐或破裂细胞内有空泡。

2、随机计数100个肥大细胞，并计数脱颗粒细胞数。按下列公式计算脱颗粒百分比：

                                           脱颗粒肥大细胞数 

脱颗粒肥大细胞(%)  =        　       ×100%

                                        脱颗粒肥大细胞数+正常肥大细胞数

结果大于30%者为肥大细胞脱颗粒试验阳性。

【思考题】

1.试用Ⅰ型变态反应发生的机理解释试验结果。

2.简述肥大细胞脱颗粒试验的 原理及应用。

综合性试验

【内容】

二十三、T淋巴细胞亚群的检测

二十四、T淋巴细胞转化试验

二十五、人体外周血中NK细胞活性检测

试验二十三、T淋巴细胞亚群的检测

(T lymphocyte subset assay)

  T淋巴细胞是一群非均质的细胞群体，担负着不尽相同的免疫功能。不同的细胞亚群，其细胞表面常有不同的分化抗原，可用已知的单克隆抗体进行鉴定。通过测定这些单克隆抗体与人体外周血淋巴细胞反应的百分率，确定T淋巴细胞亚群的比例，可辅助了解机体的细胞免疫功能状况，为某些感染性疾病、肿瘤患者的诊断提供理论依据。

  目前用单克隆抗体检测T细胞亚群的方法很多，如免疫荧光技术、流式细胞术、微量细胞毒法、花环技术、免疫酶染色技术等。

本试验综合了淋巴细胞分离、免疫荧光技术、微量细胞毒法等免疫学科技术。

以下介绍免疫荧光技术和微量细胞毒法。

（一）免疫荧光技术—间接免疫荧光法

   针对不同T淋巴细胞亚群的IgG单克隆抗体分别与T细胞表面相应的抗原结合后，再与标记有荧光素的羊（或兔）抗鼠IgG的第二抗体结合，在荧光显微镜下，结合有荧光素标记抗体的阳性细胞在黑暗背景下发出荧光。计算阳性细胞率，从而确定T细胞各亚群的数量和比例。

[材料]

1．      淋巴细胞分层液（比重1.077±0.002g/L）、 肝素溶液（200U/ml）、无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液、完全RPIM-1640培养基。

2．      鼠源性抗CD3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体，荧光素标记的羊（或兔）抗鼠IgG。

3．      离心机、荧光显微镜、毛细吸管、离心管等。

[方法]

1．      无菌采集人静脉血2ml，肝素抗凝，用密度梯度离心法分离淋巴细胞，再用完全RPIM-1640培养基调整细胞浓度至1.5×106/ml，分别加入3只尖底离心管中，每管1ml，2000rpm水平离心2min，弃上清。

2．      在3管沉淀细胞中分别加入抗CD3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体，每管100μl，置4℃冰箱45min。

3．      用Hank’s液洗涤3次，加荧光素标记的羊（或兔）抗鼠IgG，每管50μl。置4℃冰箱放置30min后再用Hank’s液洗涤3次。

4．      取沉淀细胞滴在载玻片上，覆以盖玻片，置荧光显微镜下用高倍镜观察。

[结果]

阳性细胞膜上呈现明亮的点状或帽状荧光，用“+”表示荧光强度：

—：细胞暗淡，轮廓不清楚。

+：细胞轮廓有很弱的荧光。

++：细胞轮廓荧光较强，可以确定未染荧光的细胞中心，但界限不清。

+++：细胞轮廓荧光强，可以确定未染荧光的细胞中心，界限清楚。

++++：细胞轮廓荧光很强，可以确定未染荧光的细胞中心，界限清楚。

每一标本计数200个淋巴细胞，荧光强度在++及以上者，计为阳性。按下列公式计算阳性细胞率：

阳性细胞率（%）=阳性细胞数×100

                                  200

（二）微量细胞毒法

   在补体存在的情况下，针对淋巴细胞表面CD分子的单克隆抗体与相应的CD分子结合后，可激活补体，引起相应的淋巴细胞膜穿孔，致细胞死亡。在一定时间内，膜穿孔的细胞仍能保持一定的形态而不破裂，水溶性染料如伊红或台盼蓝可进入死亡细胞内，使细胞着色，而不具有相应表面分子的淋巴细胞膜保持完整，细胞不着色。因而可通过计数死亡细胞，确定T细胞亚群的数量和比例。

[材料]

1．淋巴细胞分层液（比重1.077±0.002g/L）、 肝素溶液（200U/ml）、无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液、完全RPIM-1640培养基、新鲜兔补体。

2．鼠源性抗CD3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、阴性血清、阳性血清（抗淋巴细胞球蛋白）。

3．96孔聚苯乙烯塑料平底培养板、离心机、荧光显微镜、毛细吸管、离心管等。

4．5%伊红染料、0.8%戊二醛。

[方法]

1．      无菌采集2ml肝素抗凝血，用密度梯度离心法分离淋巴细胞。用完全RPIM-1640培养基将淋巴细胞浓度调至2×106/ml，，加入平底培养板中，每分标本加4孔，每孔10μl。

2．      分别加入抗CD3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体，10μl/孔，置湿盒37℃温育30min，同时加阴性血清和阳性血清做对照，振荡混匀5s，放湿盒37℃温育30min。

3．      加新鲜兔补体，10μl/孔，混匀后置湿盒内37℃作用60min。

4．      加5%伊红染料，20μl/孔，室温下放置10min。

5．      加0.8%戊二醛，30μl/孔，室温下静置，1周内可观察。

6．      观察前，将孔中上清液吸去一部分，将余下的培养基与细胞混合，滴入白细胞计数池，在高倍镜下观察。

[结果]

死细胞呈暗红色，无折光性，体积变大；活细胞则不着色，折光性强，体积大小正常。

计数白细胞池内4个大方格内全部淋巴细胞，按下列公式计算死亡细胞百分率：

死亡细胞百分率（%）=（实验组死亡细胞数－阴性组自然死亡细胞数）×100

4个大方格全部淋巴细胞数

[注意事项]

1．      分离的淋巴细胞放置不能超过12h，否则细胞活性降低或自然死亡，影响结果。

2．      使用的补体应新鲜、高活性并对淋巴细胞无天然毒性，使用前需作补体天然毒性实验，将毒性大的兔血清补体弃去。采集的补体要求用20只以上的兔血清混合。

3．      要求阴性对照活细胞率大于95%，阳性对照死细胞率大于95%。

试验二十四、T淋巴细胞转化试验

（T lymphocyte  transformation  test）

T细胞在体外培养时，受到某些非特异性刺激物如植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）、刀豆蛋白A（concanavalinA，ConA）、抗CD3单克隆抗体等的刺激后，细胞活化而表现出代谢旺盛，细胞内蛋白和核酸的合成增加，细胞体积增大，转化为能进行分裂增殖的淋巴母细胞。T淋巴细胞转化率的高低能一定水平地反映机体的细胞免疫水平，可作为测定机体免疫功能状态的指标之一。

体外淋巴细胞转化试验的测定主要有形态学计数法、MTT比色法和同位素掺入法。

本试验综合了淋巴细胞分离、细胞培养、细胞计数、细胞增殖测定等免疫和相关学科技术。

（一）形态学计数法

T淋巴细胞在体外受PHA刺激后，在转化为淋巴母细胞的过程中，细胞的形态和结构发生明显的变化，通过染色镜检，可计算出T淋巴细胞转化率。

[材料]

1．  PHA（50~200μg/ml）、肝素溶液（400u/ml）、瑞氏染液、完全PRIM-1640培养基。

2．  无菌注射器及针头、毛细吸管、2.5%碘酒、75%酒精等。

3．  离心机、5%CO2孵箱、显微镜、计数器、培养瓶等。

[方法]

1．  无菌采取人静脉血2ml，加入肝素管内抗凝，放入37℃恒温箱内静置30~60min（或用密度梯度离心法分离淋巴细胞）。

2．  用完全PRIM-1640培养液将PHA稀释成10μg/ml，吸取5ml加入细胞培养瓶内。

3．    用无菌毛细吸管吸取抗凝血中富含白细胞的血浆层（或分离的淋巴细胞悬液）约0.5ml，加入细胞培养瓶，置5%CO2孵箱，37℃培养72h。

4．    用毛细吸管吸取培养液，将贴壁细胞轻轻冲洗下来，收集于试管内，1000rpm水平离心5min，弃上清，吸取沉淀细胞作推片，自然干燥。

5．  瑞氏染色，高倍镜下观察推片的头、体、尾三部分。

[结果]

  已转化的淋巴母细胞多集中于推片的尾部和边缘部。

1．  淋巴细胞形态变化：观察转化淋巴细胞的形态学依据是胞核大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、有无核仁等。镜下可见以下几种类型细胞：

（1）             成熟的未转化淋巴细胞：与未受丝裂原刺激的小淋巴细胞大小一致，直径约6~8μm；核致密，染色深，无核仁；胞浆稀少，轻度嗜碱性着色，核与胞浆比例大。

（2）             过渡型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，直径约10~20μm；核仍致密，可见核仁；胞浆有所增多。

（3）             淋巴母细胞：细胞体积增大，直径约20~30μm，形态不规则，可有小突起；胞核增大，核质疏松，有明显核仁1~4个；胞浆增多，可见小空泡和颗粒，核与胞浆比例减小。

（4）             分裂相淋巴细胞：核呈有丝分裂状，可见明显染色体。

2．  淋巴细胞转化率：

计数200个淋巴细胞，转化的淋巴细胞包括上述（2）、（3）、（4）三种细胞，按下式计算淋巴细胞转化率：

淋巴细胞转化率（%）=转化的淋巴细胞数×100

                            200

正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60%~80%，50%~60%为偏低，50%以下为降低。

[注意事项]

1．  整个实验过程中注意无菌操作。

2．  吸取白细胞层时应尽量靠近红细胞层，但同时要避免吸入红细胞。

3．  培养细胞浓度以3×106 /ml为宜。

（二）MTT比色法

   MTT为四甲基偶氮唑盐，化学名是3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑。作为细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物，MTT被分解后生成蓝色甲瓒产物，沉积于细胞内或细胞周围。该产物的多少与活细胞数成正相关，并可通过酶标仪测量570nm的吸光度（OD），故可用样品的OD值反映细胞的增殖水平。此法敏感性不如同位素掺入法，但能反应活细胞数量，且可避免放射性污染，已得到广泛应用。

[材料]

1．  PHA（100μg/ml）、肝素溶液（400u/ml）、瑞氏染液、淋巴细胞分层液。

2．    完全PRIM-1640培养基、MTT（用0.01M的PBS配成5mg/ml，4℃避光保存）、20%SDS~50%DMF溶解液。

3．  无菌注射器及针头、毛细吸管、微量加样器、2.5%碘酒、75%酒精等。

4． 酶标仪、96孔平底细胞培养板、离心机、5%CO2孵箱等。

    [方法]

1．      无菌采取人肘静脉血2ml，肝素抗凝，密度梯度离心法分离淋巴细胞。

2．      用培养液调整细胞浓度为1×106 /ml，加入96孔平底培养扳，每孔100μl，共设6孔。

3．      3孔加PHA，每孔100μl ，余下3孔每孔加培养液100μl作阴性对照。加盖，置5%CO2孵箱培养56~72h。

4．      取出培养板后，每孔加MTT10μl，振荡混匀，继续培养4~6h。

5．      将培养板放入平板离心架，1000rpm水平离心5min，每孔吸去上清液100μl，再加20%SDS~50%DMF溶解液，100μl/孔。置37℃溶解3h后用酶标仪测定每孔OD570nm值。

[结果] 

PHA刺激指数（stimulation index, SI）=试验组OD570nm均值

对照组OD570nm均值

（三）3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法

T淋巴细胞经丝裂原刺激后进入有丝分裂期，转化为淋巴母细胞，同时伴有DNA和RNA合成的明显增加。此时若在培养液中加入3H-TdR，则会被作为DNA合成原料摄入到转化的细胞内。细胞增殖水平越高，掺入的放射性核素越多。测定细胞内掺入DNA中的3H-TdR放射活性，可用于反映细胞转化程度的高低。本法较形态学方法更为客观准确，较MTT法敏感性高，但需用β-液体闪烁计数仪，且有放射性污染。

[材料]

1．      完全PRIM-1640培养液、PHA（100μg/ml）。

2．      3H-TdR：原液为1mci/ml，放射性比强度为25ci/mM，用无菌生理盐水稀释成100μci/ml。

3．      玻璃纤维滤纸、负压抽滤装置、闪烁液。

4．      平底微量培养板、、微量加样器、细胞收集仪、5%CO2孵箱、β-液体闪烁计数仪等。

[方法]

1．      无菌采集人静脉血2ml，肝素抗凝，用密度梯度离心法分离淋巴细胞 ，将细胞浓度调整为1×106/ml，加入微量培养板，每孔100μl。

2．      每孔加入PHA100μl，留3孔加培养基作阴性对照，100μl/孔。加盖，置5%CO2孵箱培养56~72h。

3．      取出培养板，每孔加3H-TdR20μl，继续培养16h。

4．      用细胞收集仪将每孔培养物分别吸附到24mm直径的圆形玻璃纤维滤纸上，抽气过滤。

5．      将滤纸烘干（约1h），用镊子依次分别浸入盛有5ml闪烁液的塑料管中。

6．      在β-液闪计数仪上测定每杯样品的放射活性（cpm）。

[结果]

计算PHA刺激指数SI：SI=  刺激组的cpm均值   

阴性对照组的均cpm值

一般SI大于3为淋转实验阳性。]

试验二十五、人体外周血中NK细胞活性检测

(test for activity of natural killer cell)

  NK细胞对多种肿瘤细胞和病毒感染细胞具有很强的非特异杀伤作用，其杀伤作用不需抗原致敏，也无须抗体介导。多种药物和细胞因子都能增强NK细胞的活性。外周血NK细胞活性在一定程度上反映了机体的免疫功能状态，对指导临床用药和预测疾病转归具有重要意义。

  NK细胞活性检测方法较多，有形态学方法、MTT比色法、同位素释放法、同位素掺入抑制法。本试验综合了淋巴细胞分离、细胞培养、活细胞计数、细胞增殖测定等免疫和相关学科技术。

以下介绍MTT比色法和同位素释放法：

（一）MTT比色法

   活细胞代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶能还原MTT，生成蓝色不溶于水的甲瓒。甲瓒经溶解剂溶解后，在570nm波长具有最高吸收值，活细胞的数量和活性与甲瓒形成的多少成正相关。K562细胞是人NK细胞敏感的肿瘤细胞株，将MTT加入细胞培养液中，NK细胞会抑制K562细胞的代谢活动，从而抑制其对MTT的还原活性，抑制的程度与NK细胞的杀伤活性成正相关。

[材料]

2．      完全       PRIM-1640培养基、淋巴细胞分层液、Hank’s液、MTT（用0.01M的PBS配制成5mg/ml，4℃避光保存）、20%SDS-50%DMF溶解液。

3．      96孔平底细胞培养板、离心管、毛细吸管等。

4．      二氧化碳孵箱、微量加样器、平板离心架、酶标仪等。

[方法]

1．      靶细胞（TC）的制备

取对数生长期的K562细胞，用完全PRIM-1640培养基洗涤1次，1000rpm离心5min,弃上清，加入完全培养基0.5ml制成细胞悬液。用台盼蓝染色法计数活细胞，活细胞不着色，死细胞染为蓝色。计数200个细胞，活细胞比例要大于95%才可用。然后用完全培养基调整细胞浓度为4×104/ml。

2．      效应细胞（EC）的制备

无菌采集4ml人静脉血，肝素抗凝，密度梯度离心法分离淋巴细胞。加入完全培养基1ml制成细胞悬液。用台盼蓝染色法计数活细胞，活细胞比例要大于95%才可用。然后用完全培养基调整细胞浓度为2×106/ml。

3．      取已灭菌的96孔平底细胞培养板，按表  分组加样：

                       表   MTT法检测人NK细胞活性分组加样

注：试验组： EC:TC=40:1

将上述已加样的平板加盖，置CO2%孵箱中，37℃培养18h。

4．      取出平板，加入MTT，每孔10μl，继续培养4~6h，然后将平板放入平板离心架，平衡后，1000rpm离心5min，每孔吸去上清液110μl，然后加入溶解液100μl/孔，置37℃溶解3h后，用酶标仪测定每孔的OD570 nm值。

[结果]

NK细胞活性（%）=1-（试验组OD570 nm 均值-EC对照组OD570 nm均值）×100

                                             TC对照组OD570 nm均值

（二）51Cr释放法

  将K562细胞用51Cr预先标记后再与NK细胞共同培养。靶细胞K562被破坏后，释放出51Cr，其释放量与NK细胞的活性成正比。离心后，测定上清液的放射性强度，即可反映NK细胞活性。

[材料]

1．完全培养基、淋巴细胞分层液、Hank’s液、Na251CrO4（比放性为100~150μci/μg，放射强度为3.7~7.4×107Bq mci/ml）、6mMHCl。

2．聚丙烯塑料管、离心管、毛细吸管等、二氧化碳孵箱、微量加样器。

3．γ计数仪。

[方法]

1．      EC细胞悬液和TC细胞悬液的制备同MTT比色法。

2．      TC细胞的预标记：吸取4×106 个活细胞，加入200μci51Cr，混匀后置37℃孵育45min，每5~10min振摇1次。用完全培养基洗涤4次，配成2×105/ml的细胞悬液。

3．取聚丙烯塑料管12支，编号，按表  分组加样：

                    表   51Cr释放法检测NK细胞活性分组加样

注：试验组EC:TC=50:1

加样完毕后，置37℃CO2%孵箱中培养4h，将各塑料管1500rpm离心5min，每管吸取上清液0.5ml进行测量。

4．用γ计数仪测定每管上清液的cpm值。

[结果]

NK细胞活性（%）=试验组cpm均值-自然释放组cpm均值       ×100

最大释放组cpm均值-自然释放组cpm均值

[思考题]

1．微量细胞毒实验中，阴性组细胞死亡率大于5%，原因可能有哪些？对结果分析有什么影响？

2．淋巴细胞转化实验有何实际意义？

3．试比较两种测量NK细胞活性方法的优缺点。

设计性试验

实验二十六、可溶性抗原定量检测的设计

液体标本中可溶性抗原的定量检测可采用多种免疫学的测定方法，本实验目的是让学生根据已学过的免疫学知识和所掌握的免疫学技术，凭借实验室所提供的实验试剂、仪器和相应器材选择适当的测定方法，设计实验方案，自己动手配制试剂，完成本实验。

设计提示

1、      本试验对人血清标本中的Ig进行定量测定。

2、      可溶性抗原与相应抗体可发生特异性结合，产生肉眼可见的反应。

3、      如何利用抗原抗体的特异性结合对抗原进行定量？

4、      讨论并确定最佳实验方案，写出实验流程。

可提供的试剂和器材

1、  试剂

（１）   抗人Ig血清。

（２）   1.5%琼脂盐水、PBS。

（３）   巴比妥钠—盐酸缓冲液（0.05mol/L，pH8.6）、1%离子琼脂。

2、  仪器和器材

（１）   水浴箱

（２）   电泳仪

（３）   恒温培养箱

（４）   玻片、刻度吸管、烧杯、打孔器、微量加样器、湿盒、半对数坐标纸等。