ELISA基本步骤和主要试剂、材料
注意:本步骤为间接ELISA步骤
一 主要步骤
1 包被
取所要包被的物质,提前设计好所需浓度,根据包被孔数计算所需包被物的量,用包被液稀释至所需体积,分加至各孔中。
包被条件:两种选择:一是将ELISA板直接臵4℃过夜;也可以先臵37℃孵育2小时再转入4℃过夜。
2 洗涤
包被结束后弃掉包被液,用PBST进行洗涤,方法为PBST加满每孔,静臵5-10min,弃掉洗液,重新加满,重复洗涤3-5次,最后拍干ELISA板等待下一步封闭。 3 封闭
常用10%小牛血清,取第2步的ELISA板加封闭液至每孔,体积至少为所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择:直接臵于4℃过夜,或者臵于37℃温育2-4h,具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。
4 洗涤
封闭结束的ELISA板进行洗涤,方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。 5 加入一抗
一抗即为你要检测的物质,一般加之前需要稀释,具体稀释倍数不同实验 不同需要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释,稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条件为37℃孵育2h。
6 洗涤
具体同步骤4。
7 加相应HRP-标记的商品化二抗
加相应的商品化HRP-标记的二抗(如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗),一般也用封闭液稀释,稀释倍数参考二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔,37℃反应1-1.5h。
8 洗涤
具体同步骤4。
9 显色
常用OPD作为显色底物,但OPD致癌,也有用TMB作为底物,,这里只介绍前者。显色需要配臵显色液,具体方法为:在步骤8进行到一半使配臵显色液,为10ml底物缓冲液加0.015g OPD粉末(实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可),等待OPD完全溶解。待步骤8完成后取150ul 3%过氧化氢溶液加入之前配臵的10ml溶液中混匀,立即将此显色液分加至ELISA各孔中。然后将ELISA板臵于37℃反应约10min。
10 终止
将ELISA板取出,每孔加终止液(2mol/L硫酸溶液)终止反应,立即到酶标仪上读数(OPD为底物是读数波长为490nm,TMB为底物时波长为450nm)。
二 材料、试剂
1 ELISA板
专用于EILSA的产品称为ELISA板,国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式,需要购买。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意:聚苯乙烯材料目前只有进口,特点是孔大,加满约300ul,此时实验中所加各试剂(包被液、一抗、二抗、显色液、终止液等)均为100ul体积。而聚氯乙烯多为国产,孔较小,加满约200ul,此时各试剂只需加50ul体积即可。
2 各试剂配制
1)包被液(PH6.3的碳酸盐缓冲液)
无水Na2CO3 0.1696g
NaHCO3 0.2856g
SW 100ml
完全溶解至4℃,一周内使用
2)PBST配方
NaCl 8.0g
Na2HPO4.12H2O 2.9g
KCl 0.2g
KH2PO4 0.24g
TW-20 0.5ml
SW 1000ml
3)底物缓冲液
Na2HPO4 3.682g
柠檬酸 1.02g
DW 200ml
不需灭菌,4℃保存
4)3% H2O2
30%H2O2 100ml
SW 900ml
5)显色剂
底物缓冲剂 10ml
3%H2O2 150ul
OPD 15mg
其中H2O2 最后加
6)终止液
浓硫酸:SW = 1:8
浓硫酸缓慢加入到SW 中,并搅拌散热
三 注意事项
1 包被
所谓37℃反应,一般取一个37℃的水浴锅,在水面放一较大泡沫板,将ELISA板臵于泡沫板上即可,其余步骤的37℃反应操作同此;
整个ELISA过程中所有需要较长时间等待的步骤(包被、封闭、加一抗孵育、加二抗孵育)均需要将ELISA包起来再放入冰箱或水浴锅中,一般可直接用一次性EP手套套起来即可。
2 洗涤
最常规的洗涤步骤是洗涤3次,每次间隔5min,具体实验可能会微调,洗涤次数可以3-6次不等,间隔5-10min不等;
每次洗涤后要将ELISA板尽可能拍干后在进行下一步操作,尤其是每个洗涤步骤的最后一次洗涤要尽可能拍干,拍干可在纱布、吸水纸上进行,也可以购买洗板机。 3 显色
配制显色液时3%过氧化氢一定要最后加入,加入混匀后立刻分装到ELISA板中,即在加过氧化氢前要完全完成洗涤的操作;
OPD一般在倒数第二次洗涤前加入,要留有约10min时间以确保OPD完全溶解。 其他未尽事宜可查阅相关资料。
ELISA试剂及溶液配制
①包被液:0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)
0.75g碳酸钠,1.46g碳酸氢钠,加去离子水定容至500ml。
②0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)
0.2g磷酸二氢钾,2.90g磷酸氢二钠,8g氯化钠,加去离子水定容到1000ml。 ③抗体稀释液:0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2%BSA
0.2gBSA加配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100g。
④封闭液:0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0%BSA
2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100g。
⑤洗涤液:0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05%Tween-20
将50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中,震荡混匀。 ⑥显色液:TMB-过氧化氢尿素溶液
A液(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺,TMB):称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中,完全溶解后,加双蒸水至100ml。
B液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液,pH5.0-5.4):称取Na2HPO4·12H2O14.34g,柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水,加0.75%过氧化氢尿素
1.28ml,定容至200ml,调pH至5.0-5.4。
将A液和B液按1:l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液。
⑦终止液:2mol/L H2SO4溶液
10ml98%浓硫酸加入60ml双蒸水中,定容至100ml,室温保存。
⑧酶标二抗:HRP标记的羊抗兔 IgG,应用时用抗体稀释液稀释3000倍。
2.2.6 抗血清的分离
采集血液后,去掉针头,缓慢注入已经灭菌的三角烧瓶中,待凝固后用灭菌滴管将血液沿边缘剥离,室温放置1小时,再放入4℃冰箱过夜(不能冰冻,否则产生溶血),使血清充分析出。第二天取出后以4℃3000r/min离心30min,取上清,分装后-20℃保存备用。
2.2.7 间接ELISA法检测家兔抗血清效价
(1)抗原包被
用包被液(0.05mol/L的碳酸盐缓冲液,pH9.6)把抗原稀释为0.01mg/ml,将稀释好的抗原液于每个酶标板孔中加入100μl。把酶标板置入湿盒内,于4℃包被过夜。
(2)洗板
弃去包被液,用洗涤液加满所有酶标孔,用纱布和卫生纸包住扣干。1次,末次将水扣干。
(3)封闭
在酶联板上每孔加入250μl封闭液(pH9.6, 0.05mol/L碳酸盐缓冲液含2.0%BSA),将酶联板置于湿盒内,4℃孵育过夜。也可37℃孵育2h。
(4)弃去封闭液,洗涤1次同上。
(5)加一抗(家兔抗血清)
将免疫小鼠抗血清10μl 加到990μl 的抗体稀释液中制成1:100的抗血清。(于1.5ml的EP管中操作)。给酶标板上A行的1号孔加100μl的1:100的血清。给酶标板上A行的2到12孔各加入抗体稀释液100 μl,然后给A组的第二孔加入100μl 1:100的抗血清,吹吸十次后吸取100μl的血清加到第三孔,再吹吸十次取100μl加到第四孔,依次加到第12孔,最后从第十二孔中吸出100μl舍弃。这样每孔均为100μl,经过11次二倍稀释,血清稀释度为1:204800。B、C行同上操作。
给D行的前两个孔只加入100μl的抗体稀释液做为空白对照,3-4孔加入100μl稀释100倍的阴性血,5-6孔不加抗原,只用封闭液封闭,每孔加入100μl稀释100倍的抗血清作对照。加完后将酶连板放在湿盒内37℃孵育1h。
(6)洗涤同上。
(7)加酶标二抗
各孔加入稀释倍数为1:3000的酶标二抗(羊抗兔)100μl,37℃湿盒内孵育1h。
(8)洗涤同上
(9)显色
每孔各加A,B液50μl后将酶连板放入湿盒内避光3min左右,当阴性对照孔显蓝绿色时终止。终止时每孔加入50μl的2mol/L浓硫酸[32-34]。
(10)检测
终止后迅速用酶标仪测定酶连板各孔A405和A450的值。
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