ELISA的标本准备

在收集标本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用。对于隔天再检测的标本，及时分装后冻存在-20℃备用，有条件的，最好-70℃冻存备用。标本应避免反复冻融。

液体类标本

包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

尿液：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。

培养细胞

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

组织标本

切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

ELISA实验步骤

工作原理（以VEGF ELISA Kit为例）

血管内皮细胞生长因子（VEGF）是最重要的血管生长因子之一。二个亚单位由二硫键连接，组成分子量46-48KDa的糖蛋白质。VEGF有多个亚型。根据其亚单位所含氨基酸数量的不同，分别命名为VEGF121，VEGF144，VEGF165，VEGF189和VEGF206等。

博士德所提供的VEGF ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay, ELISA）。预先包被的抗体为单克隆抗体，克隆号26503.11。检测相抗体为多克隆抗体，经生物素（biotin）标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的VEGF呈正相关。

推荐您使用ELISA试剂盒

试剂盒中内容(96孔)

1． 重组人VEGF冻干标准品，10ng/管，总2管。

2． 预包被抗人VEGF抗体的96孔板。

3． 样品稀释液，30ml。

4． 生物素标记抗人VEGF，120μl，效价1：100。

5． 抗体稀释液，12ml。

6． 亲和素-过氧化物酶复合物（ABC），120μl，效价1：100。

7． ABC稀释液，12ml。

8． TMB显色液，10ml。

9． TMB终止液，10ml。

需要而未提供的试剂和器材

1． 标准规格酶标仪。

2． 自动洗板机。

3． 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。

4． 干净的试管和Eppendof管。

5． 使用中性PBS或TBS作为洗涤液。0.01M TBS配法为：1000ml H2O中加Tris 1.2g, NaCl

8.5g;

纯乙酸450μl或浓盐酸700μl左右调节pH值(7.2-7.6)。 0.01 M PBS（pH7.2-7.6）配法：1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g, Na2HPO4·12H2O 3.5g, NaH2PO4·2H2O 0.25g。 注意事项

1． 用户在初次使用试剂盒前，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

2． 如果不能对标本立即检测，需将标本冷冻保存。应避免反复冻融。

3． 如果可能，避免使用溶血或含脂过高的血浆。标本量大时，将标本离心或过滤。

4． 建议所有标准品、样本都做双份检测。

5． 标本VEGF含量＞2000pg/ml时，用样品稀释液按比例进行稀释，并记录稀释倍数。

6． 为避免室温不同所带来的误差，反应都在37℃进行。

洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

试剂的准备和保存

A. 人VEGF标准品的稀释和使用。

试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。

1． 配制10,000pg/ml标准品：取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。

2． 配制1000pg/ml标准品：取0.1ml 10,000pg/ml的标准品加入有0.9ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。

3． 配制500pg/ml→15.6pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3ml样品稀释液，分别标记上500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml。取0.3ml 1000pg/ml的标准品加入标记500pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3ml , 加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。

溶解后的标准品应在12小时内使用。

B．生物素标记抗人VEGF抗体工作液。

1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实际配制时应多配制0.1-0.2ml）。

2． 按1μι生物素标记抗人VEGF加抗体稀释液99μι的比例配制工作液。轻轻混匀。

C．亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。

1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实配时应多配制0.1-0.2ml）。

2． 按1μι亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液99μι的比例配制工作液。轻轻混匀。

操作程序

所有试剂用前需在室温平衡。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。如果估计样品VEGF浓度＞2000pg/ml时，应在试管中将样品用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1． 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。

2． 将1000pg/ml ，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、体液、组织匀浆或细胞培养上清，每孔先加50μι样品稀释液，再加50μι样品。

3． 酶标板加上盖，37℃反应120分钟。

4． 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体（将自动洗板机的洗涤次数设为零再开始即可）；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。

5． 将准备好的生物素抗人VEGF抗体工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。37℃反应60分钟。

6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。吸去或甩去多余液体。

7． 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。37℃反应30分钟。

8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。吸去或甩去多余液体。

9． 按每孔0.1ml依次加入TMB显色液，37℃避光反应20-25分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。

10． 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。

11． 用酶标仪在450nm测定O.D.值，将TMB空白显色孔设为对照。

12． 所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。

13． 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算(下载)。应记住由于样品稀释了1倍，其实际浓度应该×2。

操作程序总结：

1． 加样品和标准品，37℃反应120分钟。不洗。

2． 加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。0.01M TBS洗涤3次。

3． 加ABC，37℃反应30分钟。0.01M TBS洗涤5次。

4． TMB37℃反应20-25分钟。

5． 加入TMB终止液，读数。

 

第二篇：ELISA实验原理

ELISA原理 －－操作规则（新手适用）

酶联免疫吸附实验 ELISA

    一．实验目的

     酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。

    二．实验原理

    用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

     辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

   ELISA的基本原理有三条：
    （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；
    （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
    （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

    ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

基本方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

基本方法二　用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
↓
加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
↓
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

     （二） 酶与底物

    酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。

免疫技术常用的酶及其底物

     *  终止剂为2mol/L H2SO4

     ** 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。

     可催化下列反应： HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体； A—— 为有色产物。

（三） ELISA常用的四种方法

    1．直接法测定抗原

      将抗原吸附在载体表面；

      加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；

      加底物。底物的降解量＝抗原量。

     2．间接法测定抗体

     将抗原吸附于固相载体表面；

      加抗体, 形成抗原-抗体复合物；

      加酶标抗体；

      加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。

    3．双抗体夹心法测定抗原

     将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;

     加抗原，形成抗原-抗体复合物;

     加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;

     加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;

     加底物。底物的降解量＝抗原量。

    4. 竞争法测定抗原

    将抗体吸附在固相载体表面;

     （1） 加入酶标抗原；

     （2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；

     加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

    三．仪器和材料

    1. 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板, 40, 96孔）。

    2. 酶联免疫检测仪

    3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。

    4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。

     5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS－－Tween－－20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。

     6. 洗涤液：同稀释液

     7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。

     8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制 0.1M 柠檬酸（2.1g/100ml）, 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O　（7.163g/100ml）　6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。

     9. 终止液：2mol/LH2SO4。

    四.  操作步骤

    1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。

    2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

   3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。

   4. 洗涤同2。

   5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。

   6. 洗涤同2。

   7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。

   8. 洗涤同2。

   9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟。

   10. 加终止液：每孔50微升。

   11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。