ELISA试剂及溶液配制

①包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)

0.75g碳酸钠,1.46g碳酸氢钠,加去离子水定容至500ml。

②0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)

0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml。 ③抗体稀释液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2%BSA

0.2gBSA加配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100g。

④封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0%BSA

2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100g。

⑤洗涤液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05%Tween-20

将50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，震荡混匀。 ⑥显色液：TMB-过氧化氢尿素溶液

A液(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，TMB):称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。

B液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4):称取Na2HPO4·12H2O14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75%过氧化氢尿素

1.28ml，定容至200ml，调pH至5.0-5.4。

将A液和B液按1：l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液。

⑦终止液：2mol/L H2SO4溶液

10ml98%浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室温保存。

⑧酶标二抗：HRP标记的羊抗兔 IgG，应用时用抗体稀释液稀释3000倍。

2.2.6 抗血清的分离

采集血液后，去掉针头，缓慢注入已经灭菌的三角烧瓶中，待凝固后用灭菌滴管将血液沿边缘剥离，室温放置1小时，再放入4℃冰箱过夜(不能冰冻，否则产生溶血)，使血清充分析出。第二天取出后以4℃3000r/min离心30min，取上清，分装后-20℃保存备用。

2.2.7 间接ELISA法检测家兔抗血清效价

(1)抗原包被

用包被液(0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.6)把抗原稀释为0.01mg/ml，将稀释好的抗原液于每个酶标板孔中加入100μl。把酶标板置入湿盒内，于4℃包被过夜。

(2)洗板

弃去包被液，用洗涤液加满所有酶标孔，用纱布和卫生纸包住扣干。1次，末次将水扣干。

(3)封闭

在酶联板上每孔加入250μl封闭液(pH9.6， 0.05mol/L碳酸盐缓冲液含2.0%BSA)，将酶联板置于湿盒内，4℃孵育过夜。也可37℃孵育2h。

(4)弃去封闭液，洗涤1次同上。

(5)加一抗(家兔抗血清)

将免疫小鼠抗血清10μl 加到990μl 的抗体稀释液中制成1:100的抗血清。(于1.5ml的EP管中操作)。给酶标板上A行的1号孔加100μl的1:100的血清。给酶标板上A行的2到12孔各加入抗体稀释液100 μl，然后给A组的第二孔加入100μl 1:100的抗血清，吹吸十次后吸取100μl的血清加到第三孔，再吹吸十次取100μl加到第四孔，依次加到第12孔，最后从第十二孔中吸出100μl舍弃。这样每孔均为100μl，经过11次二倍稀释，血清稀释度为1:204800。B、C行同上操作。

给D行的前两个孔只加入100μl的抗体稀释液做为空白对照，3-4孔加入100μl稀释100倍的阴性血，5-6孔不加抗原，只用封闭液封闭，每孔加入100μl稀释100倍的抗血清作对照。加完后将酶连板放在湿盒内37℃孵育1h。

(6)洗涤同上。

(7)加酶标二抗

各孔加入稀释倍数为1:3000的酶标二抗（羊抗兔）100μl，37℃湿盒内孵育1h。

(8)洗涤同上

(9)显色

每孔各加A，B液50μl后将酶连板放入湿盒内避光3min左右，当阴性对照孔显蓝绿色时终止。终止时每孔加入50μl的2mol/L浓硫酸[32-34]。

(10)检测

终止后迅速用酶标仪测定酶连板各孔A405和A450的值。

 

第二篇：ELISA实验步骤及所需试剂耗材

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