实验二   蛋白质免疫印迹技术

河北大学生命科学学院2010生物技术  河北   保定  071002

摘要：目的：学习掌握动物抗血清的制备原理及技术，通过实际操作学会动物抗血清的制备，掌握Western－blotting的基本原理，熟悉Western－blotting的实验操作 。方法：，使用鸡卵类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫，获得抗血清 ，然后利用Western－blotting 检测抗血清 。结果：纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应.

关键词：常规免疫 抗血清   免疫印记  

Abstract：objective：learn to master the theory and technology

如果你找到了答案，请贡献本词条释义，利人利己

释义贡献

返回编辑

窗体顶端

te technology of preparing animals’ antiserumby operating the experiment in person ,learn to prepare the animals’ antiserum , mastering the basic principles of Western－blotting, and being  familiar with the  experiment operation of Western－blotting. Methods : using chicken ovomucoid operating the routine immunization of , and obtain the antiserum, then detecting the antiserum

through Western－blotting.

Result:Purified chicken ovomucoid can lead  to  the laboratory rat's immunoreaction

Keywords:  routine immunization      antiserum       Western－blotting

前言

免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。进行免疫之前必须具备可特异性识别目的蛋白质的单抗或多抗，以及含有目的蛋白质的粗制或纯化的样品。因此，免疫印迹可以从复杂抗原中检出特定的抗原或者从多克隆抗体中检出单克隆抗体，又可以对转移到固相膜上的抗原或抗体进行连续分析，以取得目的蛋白的定位、定性或定量。现在，免疫印记技术，在对人的病理研究上，也有了很大的应用，免疫印记法检测细胞中癌基因的表达及其意义。［1］（潘静坤. 免疫印记法检测宫颈液基细胞中HPV16、18 E6癌基因的表达及其意义［D］.中国医科大学,2006.）

1、 试剂与器材

1．1小鼠的常规免疫与抗血清的制备所需试剂与器材

注射器  蜗旋混合器 纯化的鸡卵类粘蛋白  苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠

佐剂（完全佐剂 不完全佐剂）酒精棉球  冰箱  离心机

1.2 Western Blot

12%分离胶，3.6%浓缩胶    马斯亮蓝  脱色液  PVDF膜  甲醇 电泳缓冲液

封闭液（0.5%BSA、TBST溶液）  一抗（自制多克隆抗血清以TBST按1:100比例稀释）

二抗（羊抗鼠，按1:1000比例 用TBST稀释）  DAB显色液  蒸馏水 镊子  烧杯  海绵垫

2 方法

2.1 小鼠的常规免疫和抗血清的制备

（1）抗原的提取与制备

      1）抗原为纯化的鸡卵类粘蛋白  

2）利用苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠背部

（2）初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠

     1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态

     2）用酒精棉球消毒待注射部位

     3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL

      初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫

（3）加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠

1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。

     2）用酒精棉球消毒待注射部位

     3 ）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。

（4）第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。

（5）收集抗血清（第二次加强免疫后一周后）

小鼠取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，析出血清，离心，3000rpm,10min。吸出血清，分装（0.05～0.2mL），贮于-20℃以下冰箱保存。

2.2 Western blotting检测抗血清

1.抗原SDS-PAGE

凝胶的制备：12%分离胶，3.6%浓缩胶   

抗原样品的制备：蛋白样品与样品液混合等体积混合后沸水浴5分钟。

点样：

1—3 粗品  4—5 抗原（纯品）

电泳：浓缩胶（120V）分离胶，170V

2.抗原样品经SDS-PAGE电泳后，取出凝胶，去掉浓缩胶和溴酚兰。从5、6号点样孔处将胶切开，并全切下胶的右下角作为标记，有1-5号孔的胶浸在转移电泳液中用于转移电泳；6-10号孔的胶放到考马斯亮蓝中染色15分钟，加脱色液脱色。

3.转移电泳

（1）戴上手套，剪一块与胶同样大小（？cm×？cm）的PVDF膜，甲醇活化15秒，然后浸泡在转移电泳缓冲液中15～30min待用。

（2）将海绵垫浸泡在转移电泳缓冲液中，避免产生气泡。

（3）打开转移电泳槽的塑料夹板，负极板在下，首先放上两层海绵泡沫板，再铺上用电泳液浸泡过的3～6层滤纸，依次加上凝胶、膜、3～6层滤纸、两层海绵泡沫板、正极板，各层接触后均用玻璃棒赶出之间的气泡。

（4）插入电泳槽内（注意凝胶一边在负极端），加转移电泳液，4℃冰箱中稳流15mA 进行转移电泳1h。

（5）取出膜，用冷风吹至半干，放入冰箱保存。

4.封闭

将膜放入封闭液（0.5%BSA、TBST溶液）中，37℃脱色摇床振荡反应1h。TBST振荡洗膜三次，每次用TBST 50mL，每次5min。

5.与一抗、二抗结合

（1）一抗，3毫升：自制多克隆抗血清以TBST按1:100比例稀释，即取30微升一抗，再加入3mLTBST。

（2）将膜转移至一抗（稀释好的自制抗血清）中，37℃振荡反应1h或室温反应2h以上。

（3）于TBST中洗膜三次，每次5min。

(4)加入二抗（羊抗鼠，按1:1000比例 用TBST稀释），37℃反应1h或室温反应2h以上。

(5)TBST洗膜三次，每次5min。

6.显色

(1)取10-15mL DAB显色液置于平皿中。                       

(2)将膜放入显色液中，脱色摇床上震荡直至出现条带，用大量清水冲洗以终止反应。

(3)冷风吹干，扫描杂交结果。

3   结果

 

第二篇：免疫试验设计

  免疫学实验设计

    

题目：StreamlineDireetHST分离卵黄抗体

班级：20##级临床医学本科（12）班

姓名： 

StreamlineDireetHST分离卵黄抗体

班级：20##级临床医学本科（12）班

作者及学号:

一、实验背景

1、卵黄抗体即卵黄免疫球蛋白（Egg Yolk Immunoglobulin，lgY），目前研究较多的是鸡卵黄抗体。母鸡接受免疫后，在卵黄成熟期，血液中的免疫球蛋白IgG选择性的转移到卵黄中形成IgY。IgY是一种7S免疫球蛋白，分子量180kD，由两条重链（分子量22~30kD）组成，等电点接近5.2。IgY的结构虽与IgG相似，但其Fc段氨基酸组成与IgG相差很大，不结合类风湿因子，不与蛋白A、G以及哺乳动物Fc受体和补体结合。在免疫检测中，可代替哺乳动物来源的抗体，提高监测的特异性及敏感性。已经证明特异性IgY对人及动物的许多疾病具有一定的预防和治疗作用，与其他用于被动治疗的免疫球蛋白相比，IgY具有价廉易得、稳定性好、可口服等优点，在疾病的免疫检测和防治方面具有良好的前景。

IgY具有以下优点:

（1）    由于鸡与哺乳动物的种系关系较远,可产生针对哺乳动物保守蛋白的抗体(在哺乳动物体内难以产生),用于免疫学测定“同时IgY不与类风湿因子(RF)及哺乳动物补体结合,减少了免疫检测的干扰,提高准确性”。

（2）    经特定抗原免疫后,母鸡产生对抗原的持久性应答,可不断获得特异性的多克隆抗体,其均来源于同一个体,抗体均一性好。

（3）卵黄中的IgY含量明显高于鸡血清中lgG的含量,约为巧一25mg/mL卵黄在相同的免疫时间内,由一只鸡所生鸡蛋中提取的抗体量是由一只兔的血清制备的120倍。

（4）    IgY还可抵抗幼龄动物的胃酸屏障作用,并可抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。

鸡蛋提供了廉价易得的IgY来源，从一枚鸡蛋中可获得100~250 mg IgY。如何将大量的卵黄抗体提取出来，是决定IgY能否被广泛应用的一个重要前提。鸡卵黄中含水48%、蛋白质17.8%、脂肪30.5%，其中几乎所有的脂肪都与蛋白质结合形成脂蛋白，IgY是水溶性的蛋白。从卵黄中获得卵黄抗体的过程包括IgY分离、提取和纯化高含量的脂肪及脂蛋白。

2、StreamlineDireetHST是一种新型吸附剂，主要为阳离子离子交换吸附，同时伴有疏水作用，可以用来处理高粘度的料液。

已有实验成功实现了StreamlineDireetHST对模型蛋白的静态吸附。以牛血清白蛋白(BSA)和牛血红蛋白为模型蛋白，考察了pH和盐浓度对streamlineDireetHsT吸附蛋白质的影响。结果表明,streamlineDireetHsT对蛋白质的吸附随pH的变化而变化，存在最适pH使得吸附容量最大，蛋白质分子体积的变化在一定程度上会影响吸附容量。当蛋白质与吸附剂存在静电吸引作用时，吸附过程由静电相互作用主导，吸附等温线符合Langmuir吸附方程；当存在静电排斥作用时,吸附等温线则呈现典型的多分子层吸附模式。

StreamlineDirectHST吸附剂的吸附容量大，可以在很高的料液流速下高效吸附蛋白质。料液的盐浓度对于吸附没有大的影响，对于高粘度料液不需稀释可以直接进样，所以料液可以省去很多处理步骤，节约成本，可以采用提高离子强度或是改变pH来洗脱蛋白质。

既然IgY是一种蛋白质，因此，可以设计一个StreamlineDireetHST分离卵黄抗体IgY。

二、实验原理

阳离子交换型混合模式吸附剂streamlineDirectHST对蛋白质的吸附受pH和盐浓度的共同影响。streamlineDirectHsT对蛋白质的吸附随pH的变化而变化，存在最适pH使得吸附容量最大，蛋白质分子体积的变化在一定程度上会影响吸附容量。当蛋白质与吸附剂存在静电吸引作用时，吸附等温线符合Langmuir吸附方程；当存在静电排斥作用时，吸附等温线则呈现典型的多分子层吸附模式。

卵黄抗体在pH4一9之间性质较稳定，所以本实验采用pH4一9的缓冲液进行层析分离。

三、实验目的

1、了解streamlineDirectHST分离蛋白的原理。

2、探索streamlineDirectHST对卵黄抗体分离的可行性。

四、材料与方法

1、            试剂与仪器

试剂：StreamlineDireetHST吸附剂，磷酸氢钠和磷酸二氢钠。

仪器：AKTA explorer 100层析系统，Ultrospec 3300 pro 分光光度计，台式PH/ISH测试仪。

2、            方法

（1）    卵黄水溶性组分(WSF)的提取

采用水稀释法除去卵黄中的大部分脂类。具体方法如下：取购自农贸市场的新鲜鸡蛋一只，打一小孔将蛋清倒出，将孔扩大并用蒸馏水冲洗卵黄1一2次。将卵黄倒至滤纸上吸干水分，刺破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄用蒸馏水稀释六倍，并用0.1M的HCI溶液调节pH至5.2，放入4摄氏度冰箱静置过夜。将卵黄溶液800Orpm离心30分钟，上清液中含有卵黄水溶性组分(包括卵黄抗体)，沉淀弃去。

（2）    StreamlineDireetHST分离IgY

取预处理好的卵黄稀释液的上清液，用0.2um滤膜过滤，作为进样样品，每次进样量为2ml。层析柱(内径1cm)中填充5ml Streamline Direct HST。使用AKTA explorer 100蛋白质分离纯化系统进行层析分离实验，改变平衡液与洗脱液的pH和盐浓度进行层析分离，收集各流出组分，并作lgy电泳分析。

（3）    SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳分离

配制30%凝胶贮液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、1%TEMED、10%AP、电极缓冲液与2ｘ非还原态染色液。

制板：采用8%的分离胶和3%的浓缩胶。取待电泳的样品，与等体积的2ｘ非还原态染色液混合。上样前沸水浴中3一5分钟。层析料液样品上样量为5ul,穿透液与洗脱液样品上样量为15ul。

五、实验预期结果与讨论

1、实验结果

StreamlineDireetHST成功分离了卵黄抗体

2、讨论

streamlineDireetHsT是阳离子交换型混合模式吸附剂，而卵黄抗体在pH5.0左右呈中性，净电荷为零。理论上分析，选择上样平衡液pH应该小于7.0，使IgY带正电荷，而与吸附剂产生静电吸附作用。根据此技术在蛋白质分离中的经验，在pH<4时，streamlineDirectHsT的梭基基团将渐渐趋于不解离，对蛋白质的吸附容量会减少，同时考虑到IgY在pH<3时活性将急剧降低因此选择上样平衡液的pH在4.0一6.0之间。

洗脱时改变缓冲液的pH使蛋白质带负电荷与吸附剂产生静电排斥作用。IgY等电点接近7，因此使用中性或碱性缓冲液使卵黄抗体带负电荷，与streamhneDirectHsT发生静电排斥，洗脱蛋白。IgY在pH>ll时活性开始下降,因此为保持较高的蛋白质活性，实验中洗脱液均使用pH7一10的缓冲液。

六、参考文献

1、《混合模式层析及其用于抗体分离纯化的研究》浙江大学 何瑜芳

2、《卵黄抗体对肠道感染小鼠粘膜的调节作用》大连理工大学 宗颖

3、《家禽卵黄抗体作用机理及应用现状分析》 燕海峰；邓源；朱立军；肖兵南

4、《单个B细胞抗体制备及应用》 生物工程学报 迟向阳；于长明；陈薇