热板法镇痛实验

 [摘要]目的 掌握镇痛药的实验法。观察麻醉性镇痛药度冷丁（Dolantin）和非麻醉性镇痛药罗通定（Rotundine）的镇痛效应。方法 将小鼠置于一定温度的热板上，热刺激小鼠足部产生痛反应，即舔足反应。以小鼠出现舔足的时间作用为痛反应指标，判断药物是否具有镇痛作用。结果 比较不同时间度冷丁、罗通定和对照组的痛阈提高百分率。度冷丁组、罗通定组、对照组的小鼠在注射药物前的痛阈值比较，没有显著性差异（p>0.05）；15min时，度冷丁组的小鼠的痛阈提高百分率为163.1%,痛阈值为47±14.39 s，罗通定组的小鼠的痛阈提高百分率为100%，痛阈值为34±12.47s，两者的痛阈值比较有显著性差异（p<0.05）；30min时，度冷丁组的小鼠的痛阈提高百分率为33.1%，痛阈值为24±9.72 s，罗通定组的小鼠的痛阈提高百分率为93.8%，痛阈值为38±15.00 s，两者痛阈值比较有显著性差异（p<0.05）,此时是罗通定的痛阈提高百分率较大；30min时，度冷丁组的小鼠的痛阈提高百分率为22.5%，痛阈值为22±13.06 s，罗通定组的小鼠的痛阈提高百分率为70.2%，痛阈值为35±17.64 s，两者的痛阈值比较没有显著性差异（p<0.05）。结论注射度冷丁或罗通定后痛阈值均增加。

1.材料和方法

1.1 动物：20~25克左右雌性小鼠

1.2 器材：数控超级恒温槽，金属罐

1.3 药品：0.25%度冷丁、0.25%罗通定、生理盐水

1.4 热板温度：调节温度水浴恒定于55±0.1ºC

1.5 动物筛选：筛选合格小鼠3只，30秒内有舔后足反应者，并各测定正常痛阈值一次，对逃避跳跃者弃之。

1.6实验分组

   甲鼠腹腔注射0.25%度冷丁0.1ml/10g

   乙鼠腹腔注射0.25%罗通定0.1ml/10g

   丙鼠腹腔注射生理盐水0.1ml/10g

1.7 测痛阈值 分别在注射药后15、30、60min各测痛阈值一次，并记录痛阈值。

1.8 数据统计  数据以`x±s表示，显著性差异采用t检验。 

1.9痛阈提高百分率  按下式计算痛阈提高百分率

2.结果 见表1 ，图1。

表1. 度冷丁、罗通定对小鼠痛阈的影响(n=9)

图1 度冷丁和罗通定药物对小鼠热痛阈值的影响

*p<0.05,** p<0.05,***p<0.05 vs control group

*p<0.05 vs rotundine group; ##p<0.05 vs Dolantin group ;

***p>0.05 vs Rotundine group

分析：在度冷丁实验组中，15min时，该组小鼠的痛阈值是最高的，可是在30分钟时，其痛阈值迅速下降，可能和15min实验时，小鼠在热板上停留时间（47±14.39 s）过久，导致足受伤；也有可能是实验提供的度冷丁试剂在小鼠体内发挥作用的时间过短。

3.讨论

3.1 在整个实验过程中，度冷丁组和罗通定组的小鼠与对照组的小鼠的痛阈值有显著性差异（p<0.05）。在15min时，观察记录到度冷丁组小鼠的痛阈值与罗通定组小鼠的痛阈值有显著性差异（p<0.05）,其中度冷丁小鼠的痛阈值高；30min时，观察记录到度冷丁组小鼠的痛阈值与罗通定组小鼠的痛阈值有显著性差异（p<0.05），其中罗通定组小鼠的痛阈值高；60min时，观察记录到度冷丁组小鼠的痛阈值与罗通定组小鼠的痛阈值无显著性差异（p>0.05）。在本次试验中，在15min之前，度冷丁的镇痛效果比较理想，15min~30min左右，罗通定的镇痛作用比度冷丁有效；60min后，两者镇痛效果没有显著性差异。

   原因分析：由于度冷丁的作用时间较短（吗啡皮下注射5~10mg，作用持续时间约为6小时^[1] ,而度冷丁的效价强度仅为吗啡的1/7~1/10^[1]，作用时间也较短），而罗通定的作用时间较长，一次口服60~100mg，可维持作用2~5小时^[1]，所以在试验中，开始时，度冷丁的作用强度比罗通定好；过了一段时间后度冷丁的作用强度比罗通定弱。

3.2 度冷丁和罗通定的作用机制.

3.2.1度冷丁作用机制：

疼痛刺激使感觉神经末梢兴奋并释放兴奋性递质（可能为P物质），该递质与接收神经元上的受体结合，将痛觉冲动传入脑内。感觉神经元末梢上存在阿片肽受体，含脑啡肽的神经元释放脑啡肽，后者与阿片受体结合，减少感觉神经末梢P物质的释放，恻然防止痛觉冲动传入脑内。

  Dolantin为作用于中枢神经系统的阿片受体而发挥作用的人工合成品，是吗啡的代用品。其作用机理为：Dolantin作用于中枢神经系统的阿片受体，抑制神经末梢释放P物质，细胞钙离子内流，钾离子外流，阻断神经冲动传递。

度冷丁→阿片受体→Ca2+内流↓，K+外流↑→后膜超极化→兴奋传入↓

3.2.2罗通定的作用机制：罗通定为四氢巴汀（左旋），具有良好的镇痛作用，并伴有镇静、安定和催眠作用，进入中枢后优先阻滞脑内DA受体最丰富的脑区的D2受体亚型，然后通过这些神经核与下丘脑弓状核发生神经连接，由此与内啡肽中央导水管灰质内源性抗痛系统相联系，加强脑干部位的抗痛功能，并抑制脊髓背角水平的致痛信息进人脑内，增强阿片肽的功能，最终达到镇痛目的。罗通定阻断脑内DA受体，抑制痛觉传入和痛反应，增加与痛觉有关的特定脑区域脑腓肽原和内腓肽原的mRNA的表达，促进脑腓肽、内腓肽的释放。     

参考资料：

[1] 陈季强 . 基础医学教程各论 上册 . 科学出版社 . 20##年版;351,356,357 .

[2] 李秀芹 ，杨腾飞 ，张可璇 ，吕游 ，武静茹.  罗通定协同哌替啶镇痛作用的实验研究 . 徐州医学院学报 . 2009，29(5):319~320

[3] 王云娇 ，李武毅 ，张永云 . 罗通定片镇痛、镇静作用的实验研究. 中药材. 第29卷第7期20##年7月: 713~714.

[4] 陆源，夏强. 生理科学实验 . 浙江大学出版社. 20##年版：257~258

 

第二篇：延胡索对小白鼠的镇痛作用(热板法)

实验五    延胡索对小白鼠的镇痛作用(热板法)

【实验目的】通过实验使学生掌握镇痛药常用实验方法，观察延胡索的镇痛作用，加深对兽医临床常用中药材功效的理解和记忆，并验证延胡索镇痛的药理作用。

【实验原理】延胡索能活血行气止痛，是止痛的良药。热板法是筛选镇痛药的经典方法：小鼠的足部受热板刺激而产生疼痛时，就发生舔足的特殊反应。以接触热板到舔后足所需的时间作为痛阈值，以此为观测指标。比较用药组和对照组之间痛阈值的变化，来验证药物的镇痛作用。

【实验内容】用哌替啶注射液（lmg／ml）作阳性对照，用生理盐水作阴性对照，用盐胡索水煎醇沉液（4g／ml）作药物实验，分三组，每组5只预选合格的实验小白鼠，三组分别按0.2ml／10 g用药量经过腹腔注射哌替啶注射液、生理盐水、盐胡索水煎醇沉液，纵向比较各组小白鼠在用药前后痛阈值的变化，横向比较各组实验动物在应用不同药物后痛阈值的变化，分析结果。

【实验组织】

（一） 班级进行分组，每个实验小组３名学生；

（二） 每个实验小组5只实验动物；

（三） 每４个实验小组组由一名专业教师或实验教师（兼职教师）进行指导。

【实验准备】

（一） 实验动物 小白鼠（雌性），每组预选合格数量为15只。

（二）  实验器材 鼠笼、水浴锅、烧杯（500ml）、天平、注射器、秒表、钳子、镊子、棉棒等。

（三） 实验药品 哌替啶注射液lmg／ml；延胡索水煎醇沉液4g／ml；生理盐水；苦味酸（标记用）。

【方法步骤】

（一）  预选实验动物（结合给药前第一次痛阈值测定）：调节水浴锅，使温度恒定在55±0.5℃，每次取小鼠1只，放入烧杯内。记录自放入烧杯至出现舔后足所需时间(s)，作为该鼠的痛阈值。凡30s内不出现舔后足者，弃之不用。依次测量各小鼠的痛阈值。取预选合格的小鼠15只作为实验动物。

（二）  实验动物的分组：随机分为3组，每组5只，用苦味酸标记并编号。

（三）  用药前第二次测定痛阈值：再重测痛阈1次，将两次痛阈的平均值作为该鼠给药前的痛阈值。

（四）  用药：然后，第一组腹腔注射延胡索液0.2ml／10 g，第二组腹腔注射哌替啶注射液0.2ml／10g，第三组腹腔注射等容量的生理盐水作对照。

（五）  测定给药后的痛阈值：给药后的15、30、60、90min测定各鼠痛阈值。若小鼠在热板上60s仍无痛觉反应，应取出，按60s计。将结果记入表内，按不同时间测定的各鼠痛阈值。

【数据统计】

　将实验数据按下表纪录。

【结果分析】

根据上述数据进行结果分析。包括组内分析和全班分析。

【注意事项】

1.  室温以15～20℃为宜，过低则小鼠反应迟钝，过高则过于敏感，而引起跳跃，影响实验的准确性。

2.  正常小鼠一般放入烧杯后10～15s内出现不安，举前肢，舔后足，踢后肢，跳跃等现象。这些动作均不作为疼痛指标，只有舔后足才作为疼痛的指标。

3.  一般不选用雄鼠，因雄鼠阴囊可触及烧杯底部，易呈现敏感反应，影响结果。

【问题讨论】

试述延胡索镇痛的有效成分及机理。