无菌操作技术及其重要性

  杨昆霖1    郑涛1   张雷1   张哲1   李杰2

1.北京大学医学部临床医学08级一班学生  2.北京大学医学部微生物学系副教授

【摘要】  目的：建立无菌观念，认识无菌操作的重要性，学习并掌握基本的无菌操作方法。方法：对暴露于空气中不同时间长短的琼脂培养基进行培养并观察；对不洗的手和洗过手但擦干与没擦干的手在培养基上按手印并对培养基进行培养；运用无菌接种技术接种并培养大肠埃希氏菌和表皮葡萄球菌；运用紫外光线照射培养中的细菌并观察被照射部分的菌落生长情况。结果：暴露在空气中的培养基上生长出了菌落，且菌落的数量随暴露在空气中的时间增长而增加；洗手组和不洗手组均出现了数量不等的菌落；紫外线照射下的培养基上没有菌落生长或菌落少于非照射组。

【关键词】  无菌操作；接种；培养；重要性

尽管我们的肉眼无法直接看到细菌的踪影，但在空气中，人体皮肤表层和深层，细菌却是无处不在。而在实验研究中，保证实验用具和试验用微生物不被杂菌污染显得尤为重要。生活中或是实验中，人们常常可以通过各种方法（洗液清洗、紫外杀菌等）来达到减少细菌或是灭菌的状态。本实验通过细菌培养的方法验证空气和人的皮肤存在大量细菌，运用紫外光照射培养基验证紫外线灭菌作用。

1 材料与方法

1.1材料

器材：琼脂平板培养基；洗手液；擦手巾；紫外灯；恒温培养箱；接种环；酒精灯；打火机。

菌种：大肠埃希氏菌；表皮葡萄球菌。

1.2方法

1.2.1  空气暴露组  把实验室里的八个小组按顺序依次编号为1-8组（本组为第二组），从第1组开始至第8组，分别取一块琼脂培养基，依次将培养基暴露在实验室空气中5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min；然后将培养基放入恒温箱培养两天后取出观察。

1.2.2  皮肤组  取一块培养基，将其划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个区（如图1-1），依次标注为不洗手区、洗手但不擦干区、洗手且擦干区。郑涛同学将其没洗过的食指在Ⅰ区擦拭，张哲同学用洗手液洗过双手，在未擦干前用食指在Ⅱ区擦拭,用毛巾擦干食指后再用手指在Ⅲ区擦拭。倒置，放入恒温箱培养两天后取出观察。

1.2.3  紫外线暴露组和非紫外线暴露组  取一块培养基，将其划分为上下左右四块均等的区域，并标记上A、B、C、D四个区域（如图1-2），在A、C两个区域接种表皮葡萄球菌，B、D两个区域接种大肠埃希氏菌，而且A、B两个区域为紫外线照射区，C、D两个区域用玻璃罩住。接种完后，和实验室的其他小组配合，从第8组至第1组，将接种过两种细菌的培养基放入紫外光下照射，照射时间依次为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min。照射相应时间后，倒置放入恒温箱培养两天后取出观察。

      

图1-1                              图1-2

1.2.4  统计和比较方法  简单的统计培养基各个区域的细菌菌落数量，并和对照组比较菌落数量多少。

2 结果

2.1 菌落数与培养基暴露于时间中的关系

表2-1

从培养基中的菌落可得知：看似洁净的空气中存在着大量肉眼无法看到的细菌。

从图2-1可以看出，培养基中的菌落数随培养基在空气中的暴露时间的增长而迅速变多，但在暴露10min处出现了异常，暴露10分钟和暴露5min后培养所得的菌落数都是4个。

图2-1

2.2不洗手和洗手以及洗手不擦干和擦干的对比

表2-2

从表中可以看出，洗过手后比不洗手的菌落数要多，与预期实验结果刚好相反；而洗手后擦干比不擦干的菌落数要少一些。

2.3紫外线照射组和非紫外线照射组的的对比

表2-3

从图表中可以看出，照射35分钟的两种细菌均没生长出菌落。而非照射组则生长正常。

实验室的其他小组也得到照射组比非照射组菌落少的结果。且对比发现，照射时间越长的小组，菌落数越少，大于一定照射时间后，培养基上的细菌就被完全杀灭而没有菌落长出。

3 讨论

空气中悬浮存在大量肉眼不可见的细菌，暴露在空气中的器物及人体皮肤均会受到细菌的吸附，并在器物及皮肤表面繁殖。因而在实验过程及临床护理和手术中应充分考虑空气细菌的存在，否则微生物实验中容易造成杂菌污染而影响实验结果，以及临床中出现手术感染等一系列不良情况。

对于培养基空气暴露实验中，在10min处出现异常情况，可能的原因是：由于实验小组所处的位置不一样，各个地方的空气里的细菌悬浮密度不同；加上实验室内各处空气流通情况不一致，实验人员分布不均一，有的角落人员密集，空气搅动频率快，因而可能有相对多的细菌落入培养基，而有的角落人员稀松，空气搅动和流动相对缓慢，落入培养基的细菌相对较少。以上原因都可能导致10min处菌落数出现异常。对此，在以后的实验中，可建议各个小组统一将培养基放于一个地点进行暴露，且保证通风，湿度等其他一系列因素一致。

实验结果中出现洗手组比非洗手组的菌落少的情况，而实验室中有的小组为洗手组的菌落少于非洗手组的菌落。出现洗手组比非洗手组菌落多的原因为：非洗手组和洗手组是由不同的人进行的，每个人的手指皮肤表面所带的细菌数不一致；且在培养基上按指印划痕的时间长短和面积不一致，洗手组的划痕面积大于非洗手组的。这些原因都可能导致洗手组菌落少于非洗手组的情况出现。对此，建议该实验由同一个人员完成，先进行非洗手组的实验，在由同一个人员的同一只手指进过清洗后进行洗手组的实验，这样既保证避免了不同人员之间操作存在的差异，也形成了前后对照。

对于洗手后擦干比不擦干所产生的菌落多，主要是因为不擦干的手指容易沾染空气中的细菌，且潮湿的环境容易滋生细菌繁殖。

紫外线对于细菌的杀菌作用主要是破坏细菌的DNA结构。DNA对于紫外光谱中250nm-260nm最为敏感。[3]其次，紫外辐射还能对细菌内的一些关键蛋白质类的酶起到破坏的作用，使其不能正常复制增殖，最后达到灭菌的目的。随照射时间的增长，被杀死的细菌数越多。一般认为，在260nm左右的紫外光照射30min下就可达到灭菌的状态。除此之外，紫外光杀菌的效果还与紫外光的照射强度有一定关系。[4]

由于紫外杀菌有杀菌效率高，对液体、空气杀菌方便，杀菌范围广等特点早已被运用到实验以及生活的各个领域。但对人体有一定的辐射危害，因而实验中因注意对实验人员的防护。[3]

无菌操作对于实验室研究及检验检疫工作至关重要，提高无菌意识，掌握无菌操作技术是每个微生物实验人员应具备的技能。

【参考文献】

[1] 朱万孚，庄辉. 医学微生物学，2007，8.

[2] 王月丹 等. 医学免疫学与病原生物学实验教程，2008，5.

[3] 邓小宁 译. 紫外线杀菌作用的研究,全国消毒杀菌紫外光源及装置技术研讨会，中国照明学会， 2003，6，20.

[4] 龚瑞章. 紫外线灯照射强度与杀菌作用时间测定，现代预防医学，2000,27（2）.

[5] 王燕玲，彭辉，郑雅楠. 浅谈生物检验无菌操作技术，中国质量技术监督，2008，8.

 

第二篇：微生物检查中无菌操作注意事项

微生物检查中无菌操作注意事项

一、关于采用酒精棉球消毒的注意事项

1.用酒精棉球擦拭双手，包括手掌、手背，尤其是手指，更换一个酒精棉球擦拭酒精灯附近（约10cm）桌面。

2.点燃酒精灯，在酒精灯附近拆器皿包装，并对器皿做相应标记。

3.用酒精棉球再次擦拭双手，开始实验操作。

4.消毒用酒精棉球湿度以不挤压出酒精为宜。

二、关于酒精灯正确使用的注意事项

1.酒精量以大于1/3，小于2/3为正确量。

2.防风罩应小口朝上放置于酒精灯上，反过来放置会导致氧气没有充分燃烧。

3.使用酒精灯前要检查灯芯帽是否盖得太紧，以防酒精不能上升，影响酒精灯燃烧。点燃酒精灯时严禁两个酒精灯对点。

4.熄灭酒精灯方法：先用灯芯帽扣压并熄灭火焰，再揭帽重新扣压一次。这样可防止蒸汽倒吸灯帽，再次使用酒精灯时难以揭开灯帽。

5.做样品稀释及从试管取样实验时，酒精灯应放在操作人员和试管架之间，便于无菌操作。

三、关于吸量管使用的注意事项

1.左手拿洗耳球，右手持吸量管，用右手食指平按住吸量管的顶部。

2.吸取样品后进行定量时，吸量管吸液口应贴附于试管内壁；放样时，吸量管吸液口也应贴附于试管约1/2内壁，不应贴附在管口处放液。吸量管应尽可能垂直放液。

3.用吸量管往空平皿加入1ml溶液时，吸量管应贴附于平皿底部中央位置放液；用吸量管在平板上加入0.1ml溶液做涂布接种时，吸量管应垂直、悬空放液于平板中央。

4.因吸量管拆封包装后应马上使用，故无须对吸量管吸液口过火焰消毒。

5.整个取样放样的过程应尽可能保证试管口或锥瓶口靠近酒精灯火焰附近。

四、关于样品梯度稀释的注意事项

1.从试管架上取出所需试管于酒精灯火焰附近拔出试管塞，并在火焰外焰处对试管口过火焰进行消毒。

2.将试管放回试管架后用吸量管进行取样，然后取出该试管于火焰附近调节吸量管内溶液体积。

3.取样完成后对试管口再次消毒并塞上试管塞，将试管放回试管架原处。

4.从试管架上取出所需加样的试管于火焰附近进行加样放液操作。

五、关于培养皿记号的注意事项

1.标记统一写在平皿底部边缘，以“字数少、字体小、清晰、明确”为原则。

2.标记内容包括：班级、学号、日期、培养基名称、稀释级。

六、关于平板制备的注意事项

1.打开培养皿的方法：左手小指、无名指、中指及一部分掌腹托住平皿底部，食指和拇指张开轻握皿盖侧部，以食指为支点，摆动拇指打开皿盖。打开的皿口应向着酒精灯的外焰。切勿把开口朝向操作人员。

2.手持锥形瓶中下部将瓶中培养基倾倒入平皿中央位置，锥瓶口不应接触平皿。

培养基应一次注入够量，不应分次加入（除实验特殊规定）。

3.混匀培养基时应将装有混合培养基的平皿于手中顺时针轻微摇匀2-3次，平放于桌面上后再次顺时针摇匀2-3次，整个过程应在培养基尚未开始凝固时完成。学生只要有其中一个摇匀动作也算完成混匀培养基。

4.手中装有培养基的平皿应水平放置于台面上，不应从台面边缘往里推。在位置允许的情况下，应分开平摊放置待凝。

七、关于涂布方式的注意事项

1.L型涂布棒应放平涂布。

2.涂布时应从中间按同一个方向打圈方式往周边涂布，可以重复涂布。

3.从高稀释级往低稀释级涂布时，可以不用更换涂布棒，也不用灼烧涂布棒。涂布同一个稀释级的不同平板时也不用灼烧涂布棒。但是从低稀释级往高稀释级涂布时，如不更换涂布棒，一定要灼烧涂布棒（原则上不采用这个涂布顺序）。

八、关于培养基接种的注意事项

1.液体培养基接种时不强调接种环是否应接触到液体培养基。

2.单手持两支大试管切忌手部覆盖培养基面，空白管在里面（近操作人员），菌种在外面。

九、关于接种环灭菌的注意事项

    取完固体菌时，应先垂直灼烧环部再往上灼烧其余接种丝；取完液体菌时，应先灼烧非环处的其它接种丝，再灼烧环部，这样可避免环上液体突然遇热而爆破溅出，造成污染。

以下是做参考用的，类似考评项目和分值：我们以后实训考试可否参考这些来调整我们以前的考核评分表？