蛋白质生化实验报告

生殖免疫研究所

薛樱子

学号：1133111003

实验一   溶液中蛋白质浓度的测定

一  光吸收法（测量范围：0.1—2mg）

1实验原理：由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。
纯蛋白的A280/A260为1.8，纯核酸的A280/A260为

2步骤：

2.1）打开仪器的电源开关（接220V交流电），打开比色槽暗箱盖，选择光源，选档，选波长，用调零旋钮调暗电流至0 。

2.2）将空白对照样品和待测溶液装入石英比色杯

2.3）将仪器的比色槽暗箱合上，比色槽处于蒸馏水（或校正缓冲液）校正位置，旋转光量调节器使电表指针正确处于0 。

 2.4）拉出比色槽手柄拉杆使比色槽处于样品位置读数。

 2. 5）在260nm和280nm分别读数（分别用缓冲液调0），根据上表查处相应蛋白浓度，根据喜事倍数计算原溶液蛋白浓度，根据体积计算总蛋白量。

3结果与分析：

A280=0.571   A260=0.340

根据公式：蛋白浓度=1.5 × A280 —0.75 × A260=1.5×0.571—0.75×0.340=0.6015

也可以根据蛋白质和核算含量折算图表画出一条直线估算蛋白质的浓度。

结果说明我的蛋白样品浓度是0.6015mg/ml。

二 Folin—酚法（测量范围：10-300ug/ml）

1实验原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。

2试剂：

2.1）甲液：１，4%碳酸钠；2，0.2n氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。1和2，4溶于500ml水中，然后和4以50：1混合。当天使用。

2.2）乙液：市售的Folin—酚试剂1：1稀释成乙液（1N）

3操作:

3.1）标准曲线的制作：　取12支大试管，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6毫升标准蛋白质溶液（浓度为300ug/ml BSA）。用水补足到2.0毫升，各管蛋白浓度分别为0，15ug/ml，30ug/ml，60ug/ml，90ug/ml，120ug/ml，180ug/ml，240ug/ml，300ug/ml，

3.2） 然后每支试管取0.3ml加入1.5毫升试剂甲迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.15毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀于室温（20～25℃）放置30分钟。

3.3 ）用蛋白浓度为0的管调零，650nm测各管的OD值。每个浓度的管至少测两次取它们的平均值。以A650为纵坐标，蛋白浓度为横坐标做标准曲线。

4 结果与分析

由于我当时把甲液乙液搞混淆了，所以用后面的考马斯蓝梯度浓度的蛋白重新做了，结果如下。

将这七组上数据作图得到下表：

分析图表去掉第二三个偏离直线的点，得到此方程Y=0.003X

待测蛋白的A650是0.255带入上方程得到，此蛋白的浓度为293ug /ml。

5注意事项

5.1 ）加入甲液这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。

5.2）甲液乙液不要弄混淆了

5.3 ）由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

三考马斯蓝G—250法（测量范围：10-200ug/ml）

1实验原理

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

2 试剂

2.1）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95％乙醇中，加入88％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL于4℃保存。

3 操作步骤

3.1）各取20ul，50ul，100ul，200ul，300ul，400ul标准蛋白液（500ug／ml），用蒸馏水或缓冲液稀释成1ml，各管蛋白浓度分别为10ug／ml，25ug／ml，50ug／ml，100ug／ml，150ug／ml，200ug／ml。

3.2）各取0.1ml考马斯蓝液置于微量测定板的孔中，每孔加入10ul标准蛋白或经蒸馏水稀释的待测样品，并以两孔加入同体积的蒸馏水作为空白对照。

3.3） 震荡均匀，2min后测定A595。

4 结果处理与分析

4.1）由1～6号管的数据，以蛋白质含量(mg)为横坐标，A595为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；
4.2） 求样品管A595的平均值A595；

4.3）由平均值A595从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(mg)；

分析图表得到蛋白浓度与吸光值之间的方程：Y=0.0013X+0.335 3将我们的待测蛋白代入方程得到蛋白浓度为228.07ug／ml。样品在最开始稀释了3倍，因此此结果要乘以三，则得出的最终样品蛋白浓度为228.07×3=684.2ug／ml

    实验二 FPLC系统的使用，柱效测定

1 FPLC的使用：

开机→进入界面→检查报警设置→洗泵→排气泡→接柱→选流速→基线调零→打开记录→命名结果→开始实验→保存结果

2 装柱

2.1）溶液过滤

2.2）柱子底部排气，拧紧，反向进水约2cm高，关紧出口，接上装柱器

2.3）混匀凝胶，倒出所需体积凝胶，倒进装柱器

2.4）打开出口，连接仪器和装柱器，调至凝胶耐受的最大压力，恒速装柱

2.5）柱子体积不变时，暂停，取下装柱器

2.6）调节器排气，插入柱中，固定外罗口，调节柱头至凝胶2mm深处，拧紧

2.7 ）按装柱压力继续压紧柱子，如出现空隙，再次调低柱头，至柱子体积不变，换液平衡

3测柱效

（编程，采用自动上样的方法）1％的丙酮上样500ul，流速1ml/min，观察峰形，用软件计算柱效。

4注意事项
4.1）仪器管路维护：每次工作结束后，用超纯水冲洗管路，并用20％乙醇保存管路。
4.2）系统泵的维护：将系统泵的清洁管道放入20％乙醇清洁液中，并定期更换清洁液。
4.3）所有的缓冲液和样品必须用0.45um/0.22um的微孔过滤。

5 实验结果分析

  N=5.54（Ve/W1/2）²

  Ve：开始加样至峰值的洗脱体积（保留体积）；

  W1/2：即峰高度一半处的峰宽的洗脱体积

  HETP=L/N=柱高cm/5.54（Ve/W1/2）²?100cm

  L：柱床高度（M）

  对称值As=b/a，As大于1，峰形拖尾，表示柱床过松；As小于1，峰形前伸，表示柱床过紧。离子交换层析及疏水层析，As一般在0.8与1.8之间，凝胶过滤层析，As一般在0.7与1.3之间。

结果:  根据这些公式以及计算方法测得柱效为811（N/m）。

实验三  蛋白质的脱盐冻干

1 凝胶过滤法：

1.1实验原理

凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。

2 脱盐柱手动操作方法

2.1先用注射器推入5ml水洗柱

2.2用注射器推入1.5ml样品

2.3用注射器装5ml水到柱子上

2.4 用收集管接住出口，推1.5ml，收集样品

2.5继续推入剩余的水，继续用注射器推入5到10ml水洗柱

2.6用注射器推入5ml 20%乙醇，封闭下口，移走注射器，再封闭上口

3注意事项：

每次拔注射器前都要用小盖堵住出口，每次接住注射器之前都要排走柱子上方的气泡，以保证柱子不进空气，不干柱。

3 透析法

原理：透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法

3.1 操作

脱盐→浓缩

脱盐：将透析袋一段用透析夹夹住，倒入样品，夹住另一端，查漏。置大烧杯中，加入蒸馏水，打开磁力搅拌，4小时换液一次，记录样品体积和加入蒸馏水量及体积，计算透析效率。

浓缩：将透析袋一端用透析夹夹住，倒入样品，夹住另一端，查漏。置一容器中，用PEG20000（或凝胶等）埋住，定期观察剩余体积至满意。

4 浓缩冻干

4.1 操作步骤

样品预冷→冷井预冷→打开冻干样品盖子，离心旋转→打开真空泵→浓缩后取出样品，关机，关电源。

5 实验结果分析

 无色素时：第一次是为无色素蛋白样品，第一次是从23.5ml开始加样，到50.5ml蛋白峰降到最低，统计计算出样品的量是51-23.8=27.2ml，同样第二次加样为105.5-78.5=27ml，没有色素时峰形较单一，可以直接统计出。

 有色素时： 有色素的蛋白样品峰形，色素带和蛋白带连在一起，如果单纯根据峰的出现没有办法知道什么时候停止收样，这样就根据上图的蛋白量来进行。第一次加样从24.5m开始加样，根据蛋白体积是27ml可知，应该到51.5ml就停止收样，第二次从100.5ml开始收样，到127.5ml停止收样，第三次从200ml到227ml是第三次收的蛋白样，依次按照这个方法就可以正确收到目的蛋白。

实验四  金属螯合层析

1 实验原理:

该方法是利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。

2 操作步骤：

2.1 蒸馏水洗柱，用0.5倍体积的0.1 mol／L Nicl上柱

2.2 蒸馏水洗回基线为0

2.3用5倍体积上样缓冲液平衡柱子

2.4样品调PH、过滤、上样

2.5上样缓冲液洗至基线回0

2.6 用0.02mol／L PB+ 0.5mol／L Nicl洗弱结合蛋白

2.7 柱子的再生

2.8 样品的进一步纯化

3 实验结果分析

前面有穿透峰可能是杂蛋白，当咪唑的浓度达到50％时蛋白峰出现，收集该蛋白，到75％时又有蛋白峰出现，但根据经验该峰不是目的蛋白峰，到100％时的峰表示一些高盐结合的色素被洗脱下来。对收集的样品进行脱盐处理，验证目的蛋白，75％（样品1）和100％（样品2）的进行脱盐处理时，样品1蛋白峰后出盐，然后出色素峰，但样品2就没有蛋白峰出现，只在出盐后出现色素峰，证明样品1才是目的蛋白样品。

实验五 SDS-PAGE和凝胶染色定量

1 实验原理：

SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。由于十二烷基硫酸根带负电，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别从而将将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

2试剂配制

2.1 ）10％分离胶配制（6ml）

30％凝胶贮液                    330ul

1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8        250ul

H2O                            250ul

10％ SDS                        60ul

10％过硫酸铵                    35ul

TEMED                            5ul

2.2）4％浓缩胶的配制

30％凝胶贮液                     330ul

1.5mol/L Tris-HCl,PH6.8          625ul

H2O                             1.5ml

10％ SDS                          25ul

10％过硫酸铵                      15ul

TEMED                              5ul

2.3）样品溶解液的配制

1.5mol/L Tris-HCl,PH6.8         2.5ml

10％ SDS                          2ml

甘油                              1ml

H2O                             4.5ml

溴酚蓝                          少许

                                 共10ml

2.4）电泳液的配制

Tris      3g

甘氨酸   14.4g

SDS         1g

加蒸馏水至1000ml（PH8.3）

2.5）蛋白染色和定量

考马斯蓝染液（普通）

染色液：0.1％考马斯蓝R250，用脱色液配制

脱色液：40％甲醇，10％冰乙酸，50％H2O

考马斯蓝染（定量）

染色液：0.1％考马斯蓝G250，用脱色液配制

脱色液：40％甲醇，10％冰乙酸，50％H2O

3操作步骤

 处理样品

      ↓

配置分离胶配置、浓缩胶、样品溶解液

      ↓

 上样与电泳（点样顺序：marker，蛋白样品10ul，蛋白样品20ul，待测样品）

       ↓

 考马斯蓝染色
4 实验结果分析

无结果，胶片上无条带。分析可能的原因：buffer放的是不是太久了；蛋白样品是不是降解了；染色液是不是重复用的次数太多了；

 

第二篇：生化实验报告——蛋白质部分

实验题目：蛋白质的部分性质

第一部分 蛋白质的颜色反应

一、试验原理

? 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。

二、实验仪器

1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅

三、实验试剂

1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。

2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。

3、Millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。

4、尿素晶体

5、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml

6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml

7、浓硝酸

8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.

9、 冰醋酸

10、浓硫酸

四、实验步骤

（一） 米伦（Millon’s）反应

原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚集团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。

操作：

1、苯酚实验：

取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millon’s试剂0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。

2、蛋白质实验：

取2ml蛋白液，加Millon’s试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。

（二） 双缩脲反应

原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。

操作：

1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体，有气体放出，用湿润石

蕊试纸检验，试纸变蓝，测生成气体为氨气，至液体重新结晶出现白色固体时， 停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，有紫色出现。

2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，有紫色出现。

（三） 黄色反应

原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物。

操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后颜色变为黄色。然后再加入10%NaOH溶液1ml。颜色呈橘黄色。

（四） 茚三酮反应

原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。

操作：取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。 第二部分、蛋白质的沉淀反应

一、试验原理

蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。

二、实验仪器

1、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉

三、实验试剂

1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。

2、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。

3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。

4、95%乙醇。

5、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml

6、硫酸铜溶液：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml

7、氯化钠晶体

8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml

9、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。

10、1%醋酸溶液。

四、实验步骤

（一）蛋白质的盐析作用

原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。

操作：1、取试管1支，向试管中加入蒸馏水3ml，然后加固体硫酸铵，直至其饱和（大约为50%）。取另一支试管，加蛋白液2ml，再加入上述饱和硫酸铵溶液2ml（上清液），摇匀静置数分钟，有絮状沉淀析出。

2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为

米粒大小），边加边摇，直至饱和为止，此时析出白色絮状沉淀。再加入少量蒸馏水，沉淀溶解。

（二）有机溶剂沉淀蛋白质

原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。

操作：取一试管加蛋白液1ml，，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，有白色沉淀生成。

（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质

原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。 操作：1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，有沉淀产生。

2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，有沉淀生成。

（四）生物碱试剂沉淀蛋白质

原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。

操作：取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，生成白色絮状沉淀。。