实验三    Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶

一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐

（一）目的和要求

掌握凝胶层析法的原理及操作技术。

   

（二）原理

凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。

凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular  sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。

 用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。

下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1–氯– 2、3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。

 葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/g干胶。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。

 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex G–l0～50通常用于分离肽及“脱盐”。Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。

（三）实验材料

（1）实验一所提的菠萝蛋白酶粗提样品

Sephadex G-25，1% BaCl₂溶液

（2）实验设备 

层析柱 (1.0x 25cm，1 x 10cm) 、恒流泵、自动部分收集器（х4组）、紫外检测仪，小试管架（4个）

（3）玻璃器皿

烧杯（250mL 3个х4组 ）、胶头滴管卡（2个х4组）、试管夹（1个х4组）、收集器的指管（40个х4组），铁架台（4个），10mL量筒（1个х4组）

（四）操作方法

    （1）凝胶溶胀：取5g Sephadex G-25凝胶加200mL蒸馏水充分溶胀（室温6h或在沸水浴中溶胀2h）后，除去细小颗粒，再加入与凝胶等体积的蒸馏水，除气后装柱。

添加到距柱顶2-3cm高度后，剪一圆形滤纸（比柱内径略小一些），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于（2）装柱与平衡：取层析柱1支（1cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口，加入1、4柱长的蒸馏水。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒部分，按体积比1：1左右搅拌成悬浮液，用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。凝胶表面，以免在加样时打乱凝胶层。以3倍柱体积的水流过凝胶柱，以平衡凝胶。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。平衡的同时打开紫外检测仪，让平衡液流经光路。

（3）上样：凝胶平衡后，调节紫外检测仪的T100和A0，用滴管吸除去凝胶柱上面的溶液，待液面与凝胶表面相切时，将盐析所得1mL样品小心加到凝胶柱表面（用于脱盐的上样体积可为柱体积的10%～25%），让蛋白样品溶液慢慢浸入凝胶内，迅速在凝胶柱面上加水1-2cm，连接上恒流泵进行洗脱，控制流速为0.5mL/min左右。待有蛋白样品流出后用试管收集洗脱液，每10min接1管，并记录随时间变化的A值。

（4）每管溶液中，加入2滴BaCl₂试剂，若呈现白色沉淀说明它含有硫酸铵。

结果处理
  根据实验结果，列表，按管记录白色沉淀量（以+表示多少）。分析样品脱盐效果。
  

 

二  柱层析技术分离纯化菠萝蛋白酶粗提液

一、目的

 学习利用离子交换树脂柱层析技术进一步纯化的的原理和实验技能。

二、原理

菠萝蛋白酶的等电点为9.4，为了缩短提纯时间，防止或减少自身降解，采用阴离子交换层析的方法，使其作为第一个洗脱峰被洗脱下来而得到纯化。

三.实验材料

（1）菠萝蛋白酶脱盐后的样品 , 阴离子交换树脂

（2）实验设备 :

层析柱 (1.5 x 20cm，1 x 10cm) 、恒流泵、自动部分收集器（х4组）紫外检测仪、水浴箱、752- 紫外可见分光光度计

（3）玻璃器皿

烧杯（250mL 2个х4组 ）、胶头滴管（2个х4组）、试管夹（1个х4组）、收集器的指管（40个х4组），铁架台（4个）、小试管架（4个）

（4）实验试剂

1 柱层析试剂：pH6.0 PBS 0.02moL/L 1000 mL

2 测酶活试剂和蛋白测定试剂见实验一 :

四、操作步骤：

1.树脂预处理：称取所需的量，放于0.5mol/L NaOH溶液，浸泡0.5h左右，不时搅拌。抽滤，以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将树脂浸泡于0.5Mol/L HCl中0.5h，同样抽滤液至近中性。再将树脂浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。将处理的树脂放入0.02Mol/L pH 6.0 PB液中（即起始缓冲液），静止0.5h
2. 装柱：将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，再将处理的树脂沿管壁缓慢倒入柱中。拧开螺旋夹，使流速至0.5ml/min，剪一圆形滤纸（略小于柱内径），从柱的上端轻轻放入，使其沉降于树脂表面。 继续用恒流泵加缓冲溶液平衡。同时打开紫外检测仪，让平衡液流经光路。

3. 上样与洗脱：平衡后，调节紫外检测仪的T100和A0，将柱的上端打开，用吸管将柱上面的缓冲液吸出，留一薄层液面。沿管壁缓缓加入3mL样品，拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中后，迅速加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，连接上恒流泵进行洗脱，控制流速为0.5mL/min左右。待有蛋白样品流出后用试管收集洗脱液，每10min接1管，并记录随时间变化的A值。

4.将蛋白的洗脱液收集后记录体积，装于透析袋中扎紧，并在放有PEG4000的平皿上浓缩到2mL左右，倒出记录体积，并定容于3mL收集于小试管中，即得到纯化酶液，分别检测酶活和蛋白。

五、结果处理：

（1）以洗脱体积为横坐标，吸光度为纵坐标作图，画出洗脱曲线

（2）根据粗酶和纯酶的酶活和蛋白含量测定结果，测定：①比活力②回收率③纯化倍数

 

第二篇：实验四 凝胶过滤法分离蛋白质

实验四  凝胶过滤法分离蛋白质

课程名称：生物化学与分子生物学实验课            年级：2005 

专业、层次：临床医学本科         　　　　　　   授课教师：符伟玉

职称：讲师                      　　　　　　    学时：4学时

基本教材：自编《生物化学与分子生物学实验指导》

教学目的与要求：

1、熟悉凝胶过滤法分离蛋白质的基本原理。

2、掌握凝胶过滤法分离蛋白质的实验操作。

3、掌握凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别。

大体内容与时间安排：

1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理                    10min

2、凝胶过滤法的操作示范及注意事项                10min

3、学生做实验                                    140min

教学方法：讲授式+启发式

教学重点、难点：

重点：1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理

2、凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别

3、实验操作中的装柱

难点：1、凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别

      2、实验操作中的装柱

一、实验原理

凝胶过滤又叫分子筛层析。层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部，待其与柱充分接触后随洗脱液往下渗，小分子蛋白质进入小孔内，因而在柱内停留的时间长，大分子蛋白质不能进入小孔径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。本实验高铁血红蛋白分子量大，不易渗入颗粒小孔，被排阻在凝胶颗粒之外，先流出层析柱。高铁氰化钾【K₃Fe(CN)₆】分子量小，渗透到颗粒小孔的内部，洗脱时间长，后流出。这样就可以达到分级分离的目的。

在血红蛋白(Mw＝64 500)中加入过量的高铁氰化钾(K₃Fe(CN)₆，Mw＝327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。

二、操作步骤

1、凝胶准备  称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。

2、装柱  取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高，将平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止。床面上覆盖3ml缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定5～10min后，接储液瓶，打开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。

3、样品处理

（1）血红蛋白溶液的制备：取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3 000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体积CCl₄，用力振摇3min，3 000r/min离心5min。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为10%(置4℃暂存，一周用完)。

（2）样品：血红蛋白液3滴加K₃Fe(CN)₆ 8滴和蒸馏水2滴混合，制成MetHb混合样品。

4、上样、洗脱：打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。吸混合物样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。

5、分部收集：用自动部分收集器，以5滴/min，10滴/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待黄色的K₃Fe(CN)₆色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。

6、测定：将每管收集液加入蒸馏水至4ml，混匀，在425nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，管编号为横坐标，绘出洗脱图谱。

三、注意事项

1、装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。

2、上样时一定要靠近凝胶柱表面、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。样品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层。

3、收集要及时，不能等红褐色物质流出之后再收集。

4、流速不可太快。

5、尽量保持各管收集的液量一致。

6、洗脱过程中要防止凝胶柱洗脱液流干。

7、洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃。

小     结

凝胶过滤（又名：分子筛层析）是分离蛋白质、酶、核酸等生物大分子的常用手段。葡聚糖凝胶（商品名：Sephadex）是最常用的一种具有分子筛作用的物质。

凝胶过滤主要用于分子量有明显差异的不同物质的分离。不同型号（交联度、孔径不同）的Sephadex应用于不同分子量范围。本实验应用Sephadex G-25分离高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)和高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品。