一、实验目的
(1)掌握紫外–可见分光光度计的工作原理与基本操作。
(2)学习紫外–可见吸收光谱的绘制及定量测定方法。
(3)了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱的特点。
二、实验原理
紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法,分子中的电子总是处在某一种运动状态中,每一种状态都具有一定的能量,属于一定的能级。电子由于受到光、热、电等的激发,从一个能级转移到另一个能级,称为跃迁。当这些电子吸收了外来辐射的能量,就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力,如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长,并纪录该物质在每一波长处的吸光度(A),然后以波长为横坐标,以吸光度为纵坐标作图,这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线。
当一定波长的光通过某物质的溶液时,入射光强度I0与透过光强度It之比的对数与该物质的浓度c及厚度b成正比。其数学表达式为:
(一)
式(一)为Lambert-Beer定律,是分光光度法定量分析的基础,其中T为透光率(透射比)。
物质的吸收光谱反映了它在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况,不同的物质,由于分子结构不同,吸收光谱也不同,可以从波形、波峰的强度、位置及其数目反映出来,因此,吸收光谱带有分子结构与组成的信息。
氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。20种氨基酸在可见光区域均无光吸收,在远紫外区(<220 nm)均有光吸收,在紫外区(近紫外区)(220 nm—300 nm)只有三种AA有光吸收能力,这三种氨基酸分别是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸,因为它们的结构均含有含有苯环共轭双键系统。苯丙氨酸最大吸收波长在259 nm、酪氨酸在278 nm、色氨酸在279 nm,蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基,所以其最大光吸收在大约280 nm波长处,因此能利用分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。
本实验将对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种氨基酸进行光谱测定及相关定量测定。
三、仪器和试剂
1 仪器
紫外-可见-近红外分光光度计(UV-3600或UV-2401);分析天平; 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL移液管若干;10 mL带塞比色管若干。
2 试剂
标准溶液(a): 2.0 g/L的苯丙氨酸溶液;
标准溶液(b):0.4 g/L的酪氨酸溶液;
标准溶液(c):0.4 g/L的酪氨酸溶液(所有溶液均用去离子水配制);酪氨酸待测样。
四、实验步骤
(1)分别移取标准溶液(a)(2.0 g/L,1.0 mL)、标准溶液(b)(0.4 g/L,1 mL)和标准溶液(c)(0.4 g/L,0.4 mL)标准溶液于10 mL比色管中,用去离子水稀释、定容、摇匀,待用。
(2)分别移取0.00、0.5、1.0、1.5、2.0 mL标准溶液(b)于5个10 mL比色管中,并用去离子水稀释、定容,摇匀,待用。
(3)双击分光光度计图标“UVProbe”,出现软件界面,点左下角“连接”,系统开始自检,等系统自检结束。预热15-30分钟。待仪器稳定后方可使用。
(4)在光谱测量模式下,以去离子水为参比溶液,分别绘制步骤(1)中各溶液在200~350nm波长范围内的吸收光谱。并记录各标准溶液的λmax 。
(5)在定量测定模式下,以去离子水为参比溶液,测定步骤(2)中的各标准溶液在λmax处的吸光度。
(6)在步骤5同样条件下,测定未知样品溶液在λmax处的吸光度。
五、数据处理与分析
1、将苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的吸收光谱叠加在一个坐标系中如下:
由图中可以看出,苯丙氨酸的最大吸收波长为257.73nm;色氨酸为278.70nm;酪氨酸为275.15nm。
2.对酪氨酸和色氨酸的光谱图作1-4阶导数分别如下:
一阶导数
二阶导数
三阶导数
四阶导数
通过观察可知四阶导数光谱在 230.49nm处色氨酸与酪氨酸分离最完全,故选取四阶导数处理标准液和未知样品。
3.将标准液的光谱图分别做四阶导数曲线如下:
4.将未知样的光谱图做四阶导数曲线如下:
由图知未知样在230.49nm处的吸光度为-0.048.
5.将以上述步骤测得的各标准酪氨酸溶液的吸光度为纵坐标,相应的浓度为横坐标绘制工作曲线如下:
所得直线拟合方程为:Y=5×10-4-0.0026X.
6.将未知样的吸光度(-0.048)代入得到的标准工作曲线方程,解得未知样中色氨酸的浓度为:18.654mg/L.
六、思考题
(1)本实验是采用紫外吸收光谱中最大吸收波长进行测定的,是否可以在波长较短的吸收峰下进行定量测定,为什么?
答:最大吸收处信号强度较大,误差较小,如果在较小的吸收峰下进行测定,峰值易受其它因素影响,而且读数误差较大,不是很合适。
(2)被测物浓度过大或过小对测量有何影响?应如何调整?调整的依据是什么?
答:浓度过大导致信号过大,在实际的测量中可能超出实验范围;而浓度过小可能会导致吸收峰不明显,给实验和计算带来较大误差。在实际实验中,应挑选在线性范围内的浓度相对平均合适的几个点进行测量,保证实验的准确性。
(3)思考紫外-可见分光光度法应用于蛋白质测量的依据,并设计相应的实验方案,测定奶粉中蛋白质的含量。
答:蛋白质分子中所含酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸的芳香环结构对紫外光有吸收作用。色氨酸的吸收最强,但由于一般蛋白质中酪氨酸的含量比色氨酸高许多,因此这一吸收可认为主要是由酪氨酸提供的。其最大值在280nm附近,不同的蛋白质吸收波长略有差别。在无其他干扰物质存在的条件下,280nm的吸光度即可作蛋白质的测定用,但不同种的蛋白质对280nm波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含量的不同而有差异。实验可以根据朗博比尔定律,利用配置一定浓度的标准溶液进行对照,做出标准工作曲线,再对未知样品进行测定。
紫外-可见吸收光谱实验报告
一、实验目的
学习测定有机化合物或生物大分子的测定方法;掌握分光光度计的基本操作及数据处理方法。
二、实验内容
用双光路紫外分光光度计测量已知化合物在某未知浓度时的吸光度,同时,根据实验数据用origin做出紫外光谱图,并根据朗伯-比尔 (Lamber-Beer)定律,计算所测物质的浓度。
三、实验仪器及试剂:
UV2550紫外-可见分光光度仪;
本组所测溶剂为苯甲酸。
四、实验原理
根据朗伯-比耳 (Lamber-Beer)定律:A=εbc,通过紫外分光光度计测量出最大吸收峰A,而b与ε已知,故可求得苯甲酸的浓度。
五、实验结果与讨论
1、根据图一可知,苯甲酸在λ=226nm处有最大吸收峰,此时,A=0.77525;
苯甲酸吸光度与波长关系图(图一)
2、苯甲酸在λ=226nm时的摩尔吸光系数ε=1000L/(mol·cm);
3、已知b=1cm,因此,根据据朗伯-比尔 (Lamber-Beer)定律,可求得苯甲酸的浓度c=7.75*10-4mol/L。
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