琼脂糖凝胶电泳实验

琼脂糖凝胶电泳实验技巧

核酸分子是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液(pH8.0-8.3)中,基其碱基不解离,而磷酸基团全部解离,核酸分子因而带负电荷,电泳时向正极迁移。琼脂糖主要多海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分了,使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异,从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速、通过调整其使用浓度,使得分辨率达到大多实验的要求。因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。

一、操作过程中要注意以下一些问题。

1、凝胶制作

1.1 凝胶浓度

凝胶的浓度据实验需要而变,一般在1.8%-2.0%之间,没有用完的凝胶可以再次融化,但随着融化次数的增加,水分丢失也越多,凝胶浓度则会越来越高,导致实验结果不稳定。补水办法:一是在容器上标记煮胶前的刻度,煮胶后补充水分到原刻度;二是在煮胶前称重,煮胶后补充水至原重量。粗略一点的办法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值,以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。如果条带要回收最好不要用回收胶。

1.2 梳板的选用

一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板。梳齿宽厚,形成的点样孔容积较大,用于DNA片段回收实验等;相反,梳齿窄而薄,形成的点样孔容积就较小,用于PCR产物、酶切产物鉴定等。回收的话还可以将几个齿用透明胶带粘起来,形成一个窄而长的大孔以加大点样量提高回收率。梳板的选择主要是看上样量的多少而定。一般来说,上样量小时尽量选择薄的梳板制胶,此时电泳条带致密清晰,便于结果分析。另外,每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1mm,否则,拔梳板时易损坏凝胶孔底层,导致点样后样品渗漏。当然,点样孔的破坏还与拔梳板的时间和方法有关,一般凝胶需冷却30min以上方可拔出梳板,应急的情况下可以将成型的凝胶块入4度冰箱中冷却15min左右,拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中,然后垂直向上慢慢用力,因为有液体的润滑作用,梳板易拔出且不易损坏点样孔。

2、点样

在样品加入上样缓冲液中含有甘油或蔗糖以增加密度,使样品沉入孔底;上样缓冲液中一般还含有两种指示剂,溴酚兰和二甲苯菁,用于指示样吕的迁移过程。上样缓冲液储存液一般为6倍(10倍),表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液枪基本垂直对准点样孔,用另一只手帮助固定移液枪下端,移液枪的枪头尖端进入点样孔即可将样品注入孔内。上样量的多少根据跑胶的目的而不同,一般直接跑DNA时量最少,跑一般的分子标记适中,回收时可以都加进去。最后根据扩增条带的大小点上适合的DNA Maker。

3、电泳

将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连,负极与负极相连,每次电泳时都要检查一下电极方向,以免白干(新手来做时可能就有这样的情况发生)。核酸带负电荷,从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同,电泳缓冲液刚好浸过胶为好。电泳缓冲液浓度太大则电流加大,凝胶发热,易使DNA降解。电泳早所加电压一般不超过5v/cm(正负电极之间的距离,而不是凝胶的长度)。电泳时间一般为30-60min,根据实验需要也可作适当调整。电压增高,电泳时间缩短,核酸条带相对来说不够整齐,不够清晰;相反,电压降低,电泳时间较长,条带会相对的清晰。另外,如果电泳后样品泳支很慢或者没移动可能是由于挡板没有拿开。

附 EB作用原理:观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中,大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后,其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致与DNA结合的染料呈现荧光,其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下,被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍,所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭(0.5ug/ml)时,可以检测到少至10ng的NDA条带。

DNA电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳,电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。

凝胶制备的注意事项

1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液(一些限制酶缓冲液含有高浓度盐,能减慢DNA的迁移,并可使临近孔泳带变斜)

2、琼脂糖要彻底熔化,时间不宜过长

3、EB含量要适当

4、凝胶应存放在阴凉处,再次用时加入少量电泳液,再熔化

5、检查梳子

6、拔取梳子时应均匀用力,检查凝胶孔的整齐度

7、凝胶稍厚些,避免样品溢出

上样注意事项:

1、加样时应悬空

2、加样尽可能快

3、不必每一个样品用一个吸头

4、上样量中DNA含量过高,容易产生“弯月亮”

琼脂糖核酸电泳实验操作流程

1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净,放在制胶平板上,封闭模具边缘,架好梳子;

2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶:准确称量琼脂糖干粉,加入到配胶用的三角烧瓶内,定量加入电泳缓冲液(一般20~30 ml);

3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻,加入一滴荧光染料,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,待其凝固;

4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结,小心拔出梳子,将凝胶安放在电泳槽内;

5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面1mm为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去;

6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液(loading buffer),混匀后,用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内;

7.接通电源,红色为正极,黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60~100V电压,电泳20~40min即可;

8. 根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳;

9.电泳完毕,关上电源,在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围

琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围(bp)

0.5%1,000~30,000

0.7%800~12,000

1.0%500~10,000

1.2%400~7,000

1.5%200~3,000

2.0%50~2,000

聚丙烯酰氨(PAGE)凝胶电泳:

用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离。电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷。蛋白质电泳(一般指SDS-PAGE)根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。

所以相同点就是样品都是带负电荷的,从负极向正极移动,移动的距离都和样品的分子量有关。而且这两个电泳体系可以互相交换使用。进行大分子蛋白质电泳时,可以考虑换用琼脂糖凝胶,因为该体系孔径大。相反,如果需要精确到各位数碱基的DNA电泳也可以使用聚丙烯酰胺凝胶系统,因为使用该系统可以将相差一个碱基的两条DNA链分开。

不同点首先是样品不同。这个就不用多说了。其次是结果的观察方法不同。DNA电泳普遍使用EB做染料,在紫外灯下观察;而蛋白电泳使用的考马斯亮蓝染色,还需要经过脱色步骤,不过观察起来比较简单。还有就是胶体系的差别,DNA电泳通常是一胶跑到底,而蛋白质电泳则会有分离胶和浓缩胶之区别。

 

第二篇:实验三_琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化

实验 脂糖凝胶泳及PCR物的回收

一、实验目的

1、掌握琼脂糖凝胶制备方法

2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA方法

3、掌握PCR产物回收和纯化方法

二、实验原理

    根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

电泳过程中或电泳完毕,直接利用低浓度的荧光染料EB(溴化乙锭)进行染色,EB可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出荧光,既可以确定DNA条带在凝胶中的位置,而且灵敏度很高,少至1~10 ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。

不同浓度琼脂糖凝胶分离的范围

琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。试剂盒中有一个特制的Column,将硅胶填充到这个特制的管中,利用硅胶在高盐低pH下,吸附DNA,在低盐和高pH条件下DNA可再被洗脱的原理, 进行DNA的回收和纯化。

     此外还有玻璃奶(Glassmilk法),冻融法等方法 回收纯化DNA。

三、主要实验仪器和试剂

主要仪器:

电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。

主要实验试剂:

1、50×TAE (2 M Tris,1M 醋酸,50 mM EDTA(pH8.0))

2、10×上样缓冲液(loading buffer)

3、分子量标准 DNA Marker

4、琼脂糖

5、EB (溴化乙锭)(黑暗保存)

6、DNA回收纯化试剂盒(AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒)

实验步骤

 琼脂糖凝胶的制备:

1、将洗净的电泳槽洗净,置于平整的台面上,并调节水平;

2、用1×TAE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖,微波炉加热使其溶解;

3、待琼脂糖溶液冷却至60°C左右时,加入EB(浓度约 0.025 ug/mL),搅拌均匀。缓缓将琼脂糖倒入胶模中,厚度约5至7mm;

4、插入梳子,静待琼脂糖凝固;

5、将胶模放进电泳槽中,向电泳槽倒入1×TAE电泳缓冲液,没过胶约5mm;

6、小心拔掉梳子,用20 ul移液器吸取DNA溶液(20 ul DNA 加 2~3ul 10×loading buffer),缓缓加入点样孔;并在最右边的点样孔加4 ul  DNA Maker;

7、 接通电源,(注意电源的正负极!)电泳20~30分钟;

8、电泳完毕,关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶,置于紫外灯下观察。

PCR产物切胶回收:

1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,计算凝胶重量。(100mg凝胶,计100ul体积)(尽量缩短暴露UV灯下的时间!)

2、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A(600 ul),混合均匀后,于65°C 加热,直至凝胶完全熔化。

3、加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B(300 ul),混合均匀,当分离的DNA片段小于400 bp时,加入1个凝胶体积的异丙醇。

4、吸取3中的混合液,转移到DNA制备管(置于2 ml 离心管中),12,000× g 离心1 min。弃滤液。

5、将制备管置回2 ml离心管中,加500 ul Buffer W1, 12,000× g  离心30 sec,弃滤液。

6、将制备管置回2 ml离心管中,加700 ul Buffer W2, 12,000× g 离心30 sec,弃滤液。重复一次。

7、将制备管置回2 ml离心管中, 12,000× g 离心1 min。彻底去除残余的液体。

8、将制备管置于1.5 ml离心管中,在制备膜中央,加25~30 ul 65°C Eluent或去离子水,室温静置1 min。 12,000× g 离心1 min洗脱DNA。

思考题:

1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率?

2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响?

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