医学免疫学实验讲义

（供临床医学、口腔、护理、药学、预防医学等使用）

青岛大学医学院免疫学教研室

二〇##年六月

目录

实验一 直接凝集反应——血型………………………………………（1）

实验二 类风湿因子胶乳凝集试验……………………………………（3）

实验三 抗链球菌溶血素“O”胶乳试验………………………………（4）

实验四 试管凝集反应…………………………………………………（5）

实验五 单向琼脂扩散试验……………………………………………（8）

实验六 双向琼脂扩散试验……………………………………………（10）

实验七 对流免疫电泳…………………………………………………（13）

实验八 火箭电泳………………………………………………………（16）

实验九 免疫电泳………………………………………………………（19）

实验十 补体在溶血反应中的作用……………………………………（21）

实验十一 密度梯度离心法分离单个核细胞…………………………（23）

实验十二 E玫瑰花环形成实验………………………………………（24）

实验十三 人外周血Ｔ淋巴细胞亚群的检测…………………………（27）

实验十四 淋巴细胞转化试验…………………………………………（29）

实验十五 动物过敏性休克……………………………………………（32）

实验十六 肥大细胞脱颗粒试验………………………………………（33）

实验十七 中性粒细胞的吞噬作用……………………………………（36）

实验十八 巨噬细胞的吞噬作用………………………………………（37）

实验十九 间接免疫荧光法检测抗核抗体……………………………（39）

实验二十 酶联免疫吸附试验…………………………………………（42）

实验二十一 免疫层析实验……………………………………………（45）

实验二十二 血清三碘甲状腺原氨酸（T3）放射免疫测定…………（47）

实验二十三 免疫印迹实验……………………………………………（50）

实验室规则

一、每次实验前必须将有关的课堂讲授理论及实验讲义进行预习，以了解本次实验内容及目的、方法，以免发生错误，并可提高实验效果。

二、进入实验室必须穿隔离衣。不准穿拖鞋。

三、在实验室内绝对禁止吸烟及饮食。

四、一切标本及材料应严格按照指定的方式进行使用及观察，不得随意乱动，更不得携出室外。

五、凡用过的吸管、玻片应放在指定的消毒缸内，其他物品也应放在指定地点，不得乱放。

六、应爱护显微镜，用完后应清洁镜头，显微镜对号入座。

七、实验完毕后，整理桌面、地面、用具等，需培养的物品要放入孵育箱，关好水、电、门窗。

八、爱护公物，损坏公物，应向教师报告，进行登记，酌情处理。

九、应用易燃品要严防火灾，严禁酒精灯互相直接碰头点燃，以免酒精外溢，引起燃烧。

十、必须认真观察实验结果，按时交实验报告。

实验一 凝集反应（Agglutination）——血型

颗粒性抗原与相应的抗体在一定条件下出现凝集物的现象称为凝集反应，或称直接凝集反应（direct agglutination）。若将可溶性抗原吸附或偶联至无关载体颗粒，使之成为致敏的载体颗粒，再与相应抗体结合而出现的凝集现象称为间接凝集反应（indirect agglutination），如果载体颗粒是红细胞，则称间接血凝。如将抗体吸附在载体颗粒上，然后与相应的可溶性抗原结合而出现的凝集现象称为反向间接凝集反应。

一、原理

红细胞表面具有不同的抗原，而在人类血清中天然存在有对红细胞的不同凝集素（抗体）。当红细胞与相应凝集素混合时，在有电解质参加下，可以产生凝集现象。根据人类红细胞膜上抗原的不同，可分为Ａ、Ｂ、Ｏ和ＡＢ四种血型。Ａ型血的红细胞膜上有Ａ抗原，血清中则含有抗Ｂ抗体；Ｂ型血红细胞膜上有Ｂ抗原，血清中含有抗Ａ抗体；Ｏ型血红细胞膜上不含Ａ和Ｂ抗原，血清中含有抗Ａ和抗Ｂ抗体；ＡＢ型血红细胞膜上同时有Ａ和Ｂ两种血型抗原，血清中无抗Ａ和抗Ｂ抗体。当不同血型的人进行输血时，红细胞表面抗原与相应的凝集素结合，在补体的作用下可发生溶血现象，故临床上给病人输血时，必须进行血型鉴定。同时尚需进行交互配血试验，以复查定型时有无错误，或其它不规则凝集素的存在。

二、材料

(一)标准抗A及抗B血清。

(二)生理盐水，小试管，毛细吸管，载玻片，牙签或小玻棒，刺血针，酒精棉球等。

三、方法

(一)用酒精棉球消毒被检者的耳垂或指尖，用刺血针扎破皮肤，然后用毛细吸管采血，并将其注入含生理盐水的小试管内，混匀使之成为血球悬液(浓度为1％)。

(二)取洁净玻片一张，用蜡笔在中间划分为二，并于其上角分别标记“抗A”“抗B”，分别将标准抗A和抗B血清加一滴于其上。

(三)用毛细吸管取待检红细胞悬液各加一滴于抗A及抗B血清中，然后用牙签或小玻棒将其搅拌均匀。

(四)将玻片平持手中，前后左右转动，使之充分混匀，置室温中10 ~ 15分钟。观察有无凝集发生，如观察不清，可放在低倍显微镜下观查。

四、结果

如有凝集，可见红细胞凝集成小块，背景液体较澄清；无凝集者，红细胞呈均匀分散，背景液体混浊。检查结果可参阅下表：

不同血型检查结果

抗Ａ血清   抗Ｂ血清    血型

＋        —��         A

—��      ＋           B

—��      —           O

＋��      ＋     ��    AB

 

五、注意事项��

(一)室温保持在20℃左右。若低于10℃以下，易出现冷凝集现象而造成假阳性的误判结果。

(二)用牙签或小玻棒将待检红细胞悬液分别于抗A及抗B血清混匀时，不能用同一端同时在两种血清中搅拌，而应分别用两端搅拌。

六、报告要求

结合实验结果，分析血型鉴定在实际应用中有何意义？血型不合输血引起的溶血是如何发生的？

实验二  类风湿因子胶乳凝集试验

（RF latex agglutination）

一、原理

利用人IgG致敏的颗粒性胶乳抗原与相应抗体的免疫凝集反应，测定患者血清中的类风湿因子（RF）

二、材料

1． 变性IgG致敏胶乳悬液

2． 阴、阳性对照血清。

3． 血清稀释液：生理盐水。

4． 黑色方格玻璃板、吸管、试管、吸量管等。

三、操作

1． 将待检标本用生理盐水1:20稀释备用。

2． 在黑色方格玻璃板上取三个格，每格分别加稀释待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清1滴，然后每格均加一滴胶乳试剂。

3． 充分混匀，2分钟内观察结果。

四、结果判断

    肉眼观察凝集强弱，出现清晰凝集者为阳性，无明显凝集者为阴性。若需作定量测定，可将血清作倍比稀释，重复上述测定，以血清最高稀释度所出现的凝集，即为RF滴度。

五、注意事项

1． 使用前将试剂充分摇匀。

2． 血清和试剂的液滴大小要一致。

3． 血清和试剂要充分混合。

4． 反应以室温为宜。

六、报告要求

    RF实验的原理及实验结果记录。

实验三  抗链球菌溶血素“O”胶乳试验

一、原理

正常机体的血清中含有一定量的抗链球菌溶血素“O”抗体（ASO），实验开始时首先加入一定量的溶血素“O”溶液，可全部结合正常血清中的ASO，患者血清中ASO超过正常范围，所以可以与随后加入的溶血素“O”致敏的胶乳颗粒（ASO胶乳试剂）反应，出现凝集。

二、材料

    ⒈ 溶血素“O”溶液。

    ⒉ ASO胶乳试剂（溶血素“O”致敏的胶乳颗粒）。

    ⒊ 阳性控制血清。

    ⒋ 阴性控制血清。

⒌ 生理盐水。

6．黑色方格玻璃板、试管、吸管、毛细滴管、小木签等。

三、方法

1． 血清标本用生理盐水1:50稀释，不必灭活。

2． 在反应板各格子上分别滴加稀释血清以及阳性和阴性对照血清一滴，各再滴加溶血素“O”溶液一滴，轻轻摇动2分钟，使其充分混匀，均匀分布于方格内。

3． 滴加ASO胶乳试剂一滴，轻轻摇动8分钟，室温为20℃，将反应板平放在实验桌上，有清晰凝集者为阳性，不出现清晰凝集者为阴性。

4． 阳性者的1:50稀释血清，进一步稀释为1:80，再重复步骤2和3，有清晰凝集者为强阳性。

四、结果判断

在规定的时间内观察，有清晰凝集者为阳性，不出现清晰凝集者为阴性。

五、注意事项

1． 加入ASO胶乳并轻轻摇动8分钟后，应尽快记录结果，此后时间再出现的清晰凝集不列为阳性。

2． 室温若分别降低或升高10°C，反应时间则分别延长和缩短2分钟。

六、报告要求

    ASO胶乳实验的原理及实验结果记录。

实验四 试管凝集反应（Tube Agglutination）

一、原理

试管凝集反应为半定量试验方法，用已知抗原作为诊断菌液与一系列稀释的受检血清混合保温后，观察每管内抗原凝集程度，以判定待检血清中有无相应的抗体及其效价。通常以产生明显凝集现象的最高血清稀释度为血清中抗体的效价，亦称滴度(titer)。

二、材料

(一)待检血清  用生理盐水1∶10稀释（0.1毫升血清原液 + 0.9毫升生理盐水）

(二)伤寒杆菌“H”诊断菌液

(三)伤寒杆菌“O”诊断菌液

(四) 生理盐水、试管、吸管等

三、方法

(一)稀释血清

1．洁净小试管16只，分两排排列于试管架上，每排8只，依次用蜡笔注明号码，每管用吸管加入生理盐水0.5毫升。

2．吸取1∶10待检血清0.5毫升，加入第1排中的第1管，于管内连续吹打三次，使血清与盐水充分混合(吹打时注意勿使液体溢出管外)，吸出0.5毫升注入第2管。同样予以混合后吸出0.5毫升注入第3管，以此类推作倍比稀释到第7管，自第7管中吸取0.5毫升弃去，第8管做对照。

3．同法，吸取1∶10待检血清0.5毫升加入第二排中的第1管，并依次如上法予以稀释。

  血清菌液含量表��

(二)加菌液

1．吸取伤寒杆菌“H”菌液，加入第一排各管中，每管0.5毫升(由盐水对照开始，依次由后向前加入)。此时血清稀释倍数又增加1倍。

2．同法于第二排中加入伤寒杆菌“O”菌液0.5毫升。

3．将各管振荡混匀，放37℃水浴箱中2～4小时或放入37℃孵育箱中过夜，次日取出观察结果。以出现“++”凝集的最高血清稀释度(血清的最后稀释度)为该抗体效价。

四、结果

如血清中含有与该菌相应的抗体，则可与该菌起凝集反应，凡能凝集者则细菌之凝集块下沉于管底，上面液体完全澄清或略为澄清，依照凝块之大小与液体澄清的程度而决定反应的强弱，并以“+”表示之。

“++++” 细菌完全凝集，凝集块大，管底可见大而边缘不整的白色凝集块，液体澄清

“+++”  细菌大部分凝集，凝集块较大，液体稍微混浊

“++”   细菌部分凝集，液体混浊

“+”    细菌极少数凝集，液体混浊

“-”    不凝集，液体浑浊度与对照管相同

五、注意事项

(一)先观察盐水对照管，管底沉淀物呈园形，边缘整齐，轻轻振摇，细菌分散仍呈混浊现象。

(二)实验管应自第1管看起，如有凝集，可见管底有沉淀凝集块，边缘不整齐，液体上部澄清。“H”菌液的凝集呈棉絮状，轻摇即升起，容易摇碎。“O”菌液的凝集呈紧密颗粒状，不易摇碎，往往粘于管底，因每管抗原抗体比例不同，凝集程度有差别。

六、报告要求

记录并分析实验结果。了解待测血清对伤寒杆菌“H”或伤寒杆菌“O”的凝集效价的临床意义。

实验五 单向琼脂扩散试验��

(Single Agar Diffusion Test)

一、原理

本试验为一定量试验，将一定量抗体均匀混入琼脂中倾注于玻片上，待凝固后打孔，将抗原加入孔内，抗原由圆孔中央向四周扩散，若遇相应抗体便发生特异性结合，在二者比例合适处围绕孔的周围形成乳白色的沉淀环，环的大小与抗原含量成正比，因此事先用不同浓度的已知抗原做实验绘制标准曲线，利用标准曲线便可求出未知抗原的含量(本实验以IgG定量测定为例)。

二、材料

（一）器材：

1.  载玻片。

2.            打孔器（外径3mm）。

3.            不锈钢挑针。

4.            微量注射器（10ul）。

5.            有盖搪瓷盒（内铺有湿润的海绵垫）。

6.            测定尺。

7.            温箱、三角烧瓶等其它常用仪器。

（二）试剂：

1.  pH 8.6，0.1M巴比妥缓冲液。

2.  1％琼脂凝胶： 称取10g优质琼脂粉置1000ml三角烧瓶中加人蒸馏水500ml，水浴煮沸使琼脂熔解，然后再加入500ml上述热pH 8.6巴比妥缓冲液，同时加万分之一硫柳汞，混匀后分装于150ml三角烧瓶中，4℃冰箱保存备用。

3.  1％鞣酸。

4.  参考血清：IgG。

参考血清均事先用国家标准抗原进行过标化，标明其中各种免疫球蛋白的含量。

5.诊断血清（抗体）：羊抗人IgG血清。

6. 待检血清（抗原）：人血清。

三、方法

(一)称取优质琼脂3克，加生理盐水200毫升，在水浴中加热融化。��

(二)吸4ml琼脂待其冷却至50～60℃，加入Ab(按工作浓度)，混匀后立即倒入玻璃板上，厚度为1.2毫米，待凝固。

(三)用打孔器(或用直径与其一致的钢管或玻璃管)打孔，孔距1.2 ～ 1.5厘米，两排距离2厘米。如下图：

(四)加入不同稀释度(1:10、1:20、1:40、1:80)的抗原约10微升，抗原液面与琼脂板相平为宜。

(五)置湿盒内，37℃。24小时后取出泡入生理盐水内2—3小时换水数次，再泡在1％鞣酸内10分钟。

四、结果

以毫米为单位测量沉淀环和直径，以已知的抗原浓度为横坐标，沉淀环的直径为纵坐标，绘制标准曲线，然后从标准曲线上即可查到待测样品中IgG的含量。

注：1.IgG含量可用国际单位(I.U/ml)表示，也可用mg/ml表示。��  2.血清中IgG正常值范围：��

IgG：12.0±2.62mg/ml��

IgA：2.00±0.50mg/ml��

IgM：1.10±0.30mg/ml

五、注意事项

(一)打孔时，应注意使孔之边缘整齐。��

(二)加样时，样品液面应与免疫板平齐，过多或过少将影响其准确性。��    六、报告要求

绘图记录和解释实验结果。�お�

实验六  双向琼脂扩散试验

(Double Agar Diffusion Test)

一、原理

在琼脂内抗原和抗体向四处扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出对抗原或抗体的定性分析。

二、材料

器材：

1.  洁净玻片（2.6×7.6cm）。

2.  打孔器（外径3mm），不锈钢挑针。

3.  温箱，有盖搪瓷盒，微量加样器。

试剂：

1.  pH 8.6，0.1M巴比妥缓冲液。

2.  1.2％琼脂凝胶：称取12g优质琼脂粉,置1000ml三角烧瓶中，加蒸馏水500ml，水浴煮沸使琼脂溶解，然后加入500ml上述缓冲液，内加万分之一硫柳汞后混匀，分装150ml三角烧瓶内，4℃保存备用。

3.  诊断血清（甲胎蛋白抗体），待测血清，阴性对照血清。

三、方法

1．取一清洁载玻片，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1.2%琼脂制成琼脂板。

2．凝固后，用直径3毫米打孔器打孔，孔间距为5毫米。孔的排列方式如下图所示。

图 双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图

3．用微量加样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

4．加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。

四、结果观察：

若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原——抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。

五、结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。

①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见下图。

图  双扩散试验结果示意图

A：已知抗体  a、b：阳性对照

c、d、e、f：被检材料

②抗原浓度与沉淀线形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图。

图  抗原特异性与沉淀线形状的关系

b、 b：抗体  A、A’、B：抗原

A、B完全不同 A、A’部分相同

③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度高扩散快。通常反应在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。

④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。

⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。

⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，14-21天出现的数目最多。玻片法可在1-2小时出现，一般观察72小时，放置过久可出现沉淀线重合消失。

六、报告要求：

绘图记录和解释实验结果。

实验七 对流免疫电泳��

( Counter Immunoelectrophoresis, CIEP )

一、原理

对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10～15倍。

在pH8～8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电，故由阴极移向阳极。抗体虽然也是蛋白质，但等电点比抗原高，所带阴离子少，且分子量较大，移动缓慢，同时因电渗作用(电渗是电场中溶液对于固体的相对移动。琼脂是酸性物质，在碱性溶液中，它带负电，而与它接触的溶液带正电，因此液体向阴极移动，产生电渗)反而向阴极泳动。因此，在电场作用下，抗原向阳极方向移动，抗体向阴极方向泳动，形成对流，在抗原抗体比例合适处，形成白色沉淀线。此法常用于AFP等的检测。��

二、材料

（一）器材：

1.  洁净玻板（2.6×7.6cm）。

2.  打孔器（外径3mm）。

3.  不锈钢挑针。

4.  电泳槽及电泳仪。

5.  万用电表。

6.  温箱、有盖搪瓷盒及其它常用仪器。

（二）试剂：

1.       pH 8.6，0.05M巴比妥缓冲液。

2.       1.2％琼脂：用上述缓冲液加热溶解配制，内加万分之一硫柳汞，4℃保存。

3.       甲胎蛋白阳性对照血清（或脐带血）。

4.       甲胎蛋白抗血清。

5.       甲胎蛋白阴性对照血清。

三、方法：

1. 取热溶的1.2％琼脂4.5ml，浇于2.6×7.6cm玻璃板上，待琼脂凝固后，放入有盖搪瓷盒的海绵垫上，置4℃保存备用。

2. 用时取琼脂板打孔，孔径0.3cm，孔距0.4～0.5cm，孔底补以少量琼脂，如下图：

 3. 用滴管按顺序第1、3列加抗原（待测样品，阳性及阴性甲胎蛋白对照）。2、4列加甲胎蛋白抗血清，至完全充满孔为止，防止溢出孔外，每个样品需更换一支滴管。

4. 将上述加好样的琼脂板置电泳仪上，抗体端接上正极，抗原端接上负极，（每泳完一次调换阴阳极保持液体电解离子平衡）。用滤纸或纱布做引桥，板端电压3—4V/厘米。通电1—2小时(或45分钟)，然后取下观察结果，如若沉淀线不清楚，可置一定湿度的盒内，置37℃孵育箱4小时(或取掉滤纸引桥，在电泳槽内放置4小时)再观察。

四、结果观察

在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。

五、影响结果的因素

（1）     抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加，抗原抗体的比例发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔逐步移向两孔中间，并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。

（2）     几组电泳缓冲液，其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度最高。巴比妥—巴比妥钠次之。Tris缓冲液更差。

（3）电压与电流小时电泳时间需要长些，电压电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验结果。

六、注意事项

(一)抗原孔与抗体孔之间的距离不易太宽。��

(二)电泳仪中的液体量应充足，防止纱布做引桥时不导电。��

(三)电压应适当。��

七、报告要求：

记录并分析实验结果。�お�

实验八 火箭免疫电泳

( Rocket Immunoelectrophoresis, RIE )

一、原理

火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为：在电场作用下，抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动，二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线，而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系，因此本法可以测定样品中抗原的含量。

二、材料

（一）器材：

1.  洁净玻璃板（7×11.5cm）。

2.  打孔器（外径5mm），不锈钢挑针。

3.  电泳仪及电泳槽，纱布。

4.  微量加样器。

（二）试剂：

    1. 1％琼脂糖：称取1g优质琼脂糖粉置，100ml三角烧瓶中，加pH 8.6，0.025M巴比妥缓冲液50ml，水浴煮沸使琼脂糖粉溶解，然后加入50ml上述缓冲液，内加万分之一硫柳汞后混匀即可。

    2. pH 8.6，0.05M巴比妥缓冲液： 将单向琼脂扩散用的pH 8.6，0.1M巴比妥缓冲液，以蒸馏水作1:2稀释即可用于电泳槽，也可用于制备1％琼脂糖。

    3. 抗血清：羊抗人IgG诊断血清（效价1:80）。

    4. 标准抗原（参考血清）：同单向琼脂扩散。

    5. 1％鞣酸生理盐水。

6. 凝胶指示剂：配制见“免疫电泳试验”。

三、方法

1. 做琼脂板：取加热溶解的1％琼脂糖24ml,冷至56℃,加入一定量的羊抗人IgG诊断血清,使诊断血清的最终稀释度符合瓶签所标的“工作浓度”充分混匀,迅速浇板(板四周打蜡,平放)。

   2. 打孔：琼脂凝固后，如下图用打孔器打孔，孔间距0.5cm，用针挑去孔内琼脂柱。

 

    3. 加样：以微量加样器向第1、2孔内准确加入待检血清30ul，其余孔依次加入不同稀释度的参考血清各30ul，最后一孔加指示剂30ul。

    4. 电泳：反应板的打孔端放于阴极一侧，另一端放于阳极一侧，两端用三层纱布搭桥，在pH 8.6，0.05M巴比妥缓冲液的电泳槽内进行电泳，端电压3─4V／cm，电流1─2mA／cm，电泳4─5小时。

5. 电泳结束后，将反应板浸泡于1％鞣酸生理盐水中， 15分钟后观察结果。

四、结果判断

阳性结果可见清晰的火箭形沉淀峰，自小孔中心至火箭峰顶的距离，作为沉淀峰的高度，以已知标准抗原含量的对数作横座标，沉淀峰高度作纵座标，绘制标准曲线。用此标准曲线可计算出待检标本中的IgG。

五、影响结果的因素

1. 所用琼脂要选择无电渗或电渗很小的，否则火箭形状不规则。

2. 注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形皆提示未达终点。

3. 标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小）后再加样。否则易形成宽底峰形，使定量不准。

4. 作IgG定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火箭峰因电渗呈纺锤状。

5. 火箭电泳作为抗原定量智能测定 μg/ml 以上的含量，如低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。

六、报告要求

记录并分析实验结果。��

实验九 免疫电泳实验

( Immunoelectrophoresis, IEP )

一、原理

免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，然后于凝胶槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适宜部位形成特异的抗原抗体沉淀弧线。每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗原成分分析；且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定。

二、材料

（一）器材：

1.  玻璃载玻片（26×76mm）。

2.  打孔器（外径3mm）。

3.  尖头不锈钢挑棒。

4.  挖槽刀。

5.  电泳仪，电泳槽及万用电表。

6.  有盖搪瓷盒（内铺有湿海绵垫）。

（二）试剂：

1.  pH 8.6，0.05M巴比妥缓冲液。

2.  1.2％琼脂：取1.2g优质琼脂粉置1000ml三角烧瓶中，加入上述缓冲液500ml，水浴煮沸使琼脂粉溶解，然后再加入500ml上述热缓冲液，同时加万分之一硫柳汞， 混匀后分装于150ml三角烧瓶中，4℃水箱保存备用。

3.  凝胶指示剂配制：

        葡萄糖            0.5g

        偶氮胭脂红        0.1g或氨基黑10B，0.1g

    pH 8.6，0.05M巴比妥缓冲液20ml，保存于4℃冰箱备用。

三、方法

1.琼脂板制备：将洁净之载玻片置于平台上,用吸管吸取4ml热溶的1.2％琼脂溶液于载玻片上，待凝固后按下图打孔及开槽。

2.加样：用不锈钢挑棒挑去小孔中琼脂，用毛细滴管（或加样器）加入待检样品充满小孔。一般待检样品的pH与离子强度最好能与琼脂相同。蛋白含量一般在20mg／ml以下，否则需要用缓冲液稀释后再进行电泳。

    3.加指示剂:为了便于控制电泳泳动速度，可在待测样品孔中加少许凝胶指示剂，氨基黑10B或偶氮胭脂红染色白蛋白，因此，可根据染料的移动，指示蛋白成分的泳动。

    4.电泳：琼脂板两端以三层吸水性强的滤纸为电桥，每边覆盖1cm，控制电压4～6伏/cm，电泳1.5小时，一般当指示剂泳动至离末端1cm处，停止电泳，为了防止电泳后两个电泳槽中的缓冲液pH与离子强度改变，每次电泳后应更换正负电极或将两槽缓冲液混合。

5.扩散：电泳后用不锈钢挑棒挑去槽内琼脂，然后加入相应抗体充满槽内，置铺有海绵垫的搪瓷盒内，放在25℃温箱中扩散24～72小时，连续观察结果至沉淀弧线完全清晰为止。

四、结果判断

电泳扩散后可以直接观察，也可染色后观察。无色标本观察需在黑色背景下，用斜射光观察，必要时借助放大镜（2～5倍为宜）。染色标本与上述相反，需在白色背景下，斜射光观察才清楚。

五、影响结果的因素

抗原含量越多，则反应沉淀线越接近抗体槽，形成的沉淀弧较粗，反之，则形成的沉淀线较细。以此可做细微的蛋白质组分分析。通过与正常血清形成的沉淀弧数量、位置和形态进行比较，可分析标本中所含抗原成分的性质和含量。该法常用于血清蛋白种类分析，如骨髓瘤及性联丙种球蛋白血症的诊断。

六、报告要求

记录并分析实验结果。

实验十   补体在溶血反应中的作用

(Action of Complement in Hemolysis)

一、原理

红细胞与相应抗体(溶血素)结合成抗原抗体复合物，可通过经典途径激活补体，导致红细胞的溶解，呈现溶血现象。

二、材料

(一)2％绵羊红细胞

(二)1∶100溶血素(兔抗绵羊红细胞抗体)

(三)1∶30补体(新鲜豚鼠血清)

(四)生理盐水、小试管

三、方法

（一）取洁净小试管3支，用蜡笔分别标记“1”、“2”、“3”。

（二）每支小试管加入2％绵羊红细胞悬液0.5ml。

（三）于“1”号管内分别加入1∶100溶血素0.5ml和1∶30补体0.5ml

（四）于“2”号管内分别加入1∶100溶血素0.5ml和生理盐水0.5ml

（五）于“3”号管内分别加入1∶30补体0.5ml和生理盐水0.5ml。

（六）置37℃水浴15分钟。

四、结果

“1”号管红细胞出现溶血现象。

“2”号管和“3”号管红细胞均匀沉淀于管底。

五、注意事项��

(一)盐水、绵羊红细胞、溶血素均应新鲜配制。夏季宜将试剂置4℃预冷，以稳定补体效价。

(二)所用试管应洁净。

六、报告要求

记录并分析实验结果。

实验十一  密度梯度离心法分离单个核细胞

一、原理

常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞

二、器材

1.  水平离心机，显微镜。

2.  细胞计数板，血红蛋白吸管。

    试剂：

1.  Hank's液（无钙镁）应用液。

2.  淋巴细胞分离液：（比重1.077～1.078）。

三、操作

    ⒈取抗凝全血作白细胞计数(肝素稀释液1000单位／ml,采2ml血约需0.025ml＝1滴放入管中）。

    ⒉抗凝全血2ml加等量Hank's液，边加边摇充分混匀。

    ⒊用滴管将稀释血沿管壁徐徐加入已盛有2ml淋巴细胞分离液的试管中，使血液平铺于淋巴细胞分离液之上。

    ⒋离心2000转／分20分钟。

   ⒌用滴管吸出单个核细胞层的细胞，加入预先准备好的5ml Hank's液中，用滴管混匀，离心1500转／分10分钟，弃上清，将试管底部的细胞充分混匀， 再加足量Hank's液，洗涤2次（每次1500转／分，5分钟）。

⒍将细胞悬液体积还原至1ml，取样计数分别记录白细胞数和单个核细胞数。

四、结果

    细胞的活力（％）鉴定，用锥兰液进行检查，染料渗入死细胞内使细胞着色，活细胞排斥染料不被着色，显微镜下可观察到二者的区别。

    附：

    锥兰染液的配制：锥兰1克研磨成粉末，用100ml蒸馏水调匀或加热溶解, 滤纸过滤装瓶。

实验十二 E玫瑰花环试验��

(Erythrocyte Rosette Test)

一、原理��

人类T淋巴细胞表面存有绵羊红细胞(sheep red blood cells，RSBC)受体(E受体)。在一定条件下,SRBC可吸附在T淋巴细胞周围,形成以T淋巴细胞为核心周围环绕SRBC状如玫瑰环样的细胞集团。能够吸附三个以上SRBC的淋巴细胞称为T花环形成细胞(T rosette forming cell，TRFC）。E受体是T淋巴细胞独有的表面标志，因此E玫瑰花环试验可用于人外周血中T淋巴细胞的鉴定和计数。是测定机体细胞免疫功能的指标之一。临床上常做为某些疾病（淋巴系统增生性疾病，恶性肿瘤，自身免疫病等）的诊断，判定疗效，估计预后的参考指标。��

二、材料��

(一)肝素(25u/ml)，淋巴细胞分层液(聚蔗糖—泛影葡胺)，Hank's液，1％SRBC，灭活小牛血清。��

(二)1ml吸管，注射器、针头、碘酒等。��

三、方法��

(一)1％SRBC悬液制备：��

取脱纤维绵羊血1—3ml，加等量Hank's液，混匀后1500rpm离心5—8分钟，洗3次最后用Hank's液配成1％悬液。��

(二)分离淋巴细胞��

1.  取小试管一支加分层液2毫升。

2.  取肝素抗凝的待检血1.5毫升沿管壁轻轻加在分层液上面，切勿混合。

3.  2500rpm离心25分钟。

4.  用滴管吸取淋巴细胞层置另一小试管中，用Hank's液洗二次(2000rpm离心10分钟)，最后一次用细胞计数(计数方法：于另一小试管中，加0.38毫升的细胞稀释液与0.02毫升的细胞悬液混匀，在血球计数板上数出4个大方格的总数。总数×50×1000＝每毫升淋巴细胞数)。
并将其配成1×107/ml浓度的淋巴细胞悬液。��

(三)花环形成��

1.  取107淋巴细胞/ml悬液0.2ml，1％SRBC悬液0.2ml和经绵羊红细胞吸附后的小牛血清(不经吸附也可)0.1毫升，在小试管中混合，置37℃孵育5分钟。

2.  取出后2000rpm离心5分钟，放4℃冰箱20分钟。

3.  取出后轻轻摇动重新悬浮细胞，加半滴美兰液，用滴管吸细胞悬液一滴放载玻片上，加盖玻片后于高倍镜下计数。��

四、结果��

高倍镜下计数200个以上的淋巴细胞中TRFC的百分数。��

凡能结合三个以上SRBC者为TRFC。

TRFC（%）=          TRFC×100％

��              未形成花环淋巴细胞数＋TRFC��

五、注意事项��

(一)检测的血标本要新鲜，放置时间不要超过3—4小时。��

(二)试验用的SRBC要新鲜，脱纤维血4℃保存不得超过10天。��

(三)绵羊红细胞与淋巴细胞的比例以16∶1—50∶1为宜。��

(四)E花环计数前，应轻轻旋浮，不能用滴管用力吹打，否则会使形成的花环脱落。��

六、报告要求��

绘图记录并分析实验结果。�お�

实验十三 人外周血T淋巴细胞亚群的检测��

(Detection of T Lymphocyte Subsets In Human Peripheral Blood)��

一、原理��

T淋巴细胞表面具有一系列分化抗原，根据分化抗原的不同可将T细胞分为不同的亚群，如CD3、CD4、CD8等。抗人T淋巴细胞亚群的单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)与T淋巴细胞表面相应抗原特异性结合，然后以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗鼠IgG与细胞作用，如底物显色，阳性细胞周边被染为褐色环。T淋巴细胞亚群的检测可做为测定机体细胞免疫功能的指标及用于各种与细胞免疫功能异常有关疾病的辅助诊断。��

二、材料��

(一)新鲜肝素抗凝血；��

(二)淋巴细胞分层液；

(三)pH7.4的PBS；��

(四)丙酮—福尔马林固定液；��

(五)抗人淋巴细胞亚群McAb CD3/CD4/CD8；��

(六)HRP——羊抗鼠IgG；��

(七)底物液；

(八)Maryer's苏木素染液。��

三、方法��

(一)淋巴细胞分离。��

1.  取肘正中静脉血1ml，加入肝素(25u/ml)抗凝的小试管内。

2.  取小试管一只加淋巴细胞分层液1ml。

3.  取肝素抗凝的待检血1ml沿管壁轻轻加在分层液面上，切勿混合。

4.  2500rpm离心25分钟。

5.  用滴管吸取淋巴细胞层之细胞置一小试管中，用PBS液洗二次(2000rpm离心10分钟)最后一次作细胞计数(计数方法：于另一小试管中加0.38毫升细胞稀释液与0.02毫升的细胞悬液混匀，在血球计数上取出4个大方格的总数(总数×50×1000＝每毫升淋巴细胞数)。并将其配成1×10��6个细胞/ml的悬液。

6.  将淋巴细胞悬液涂于10孔抗原片上，每孔20μl，一份标本涂3片，空气中干燥。

7.  将玻片放入4℃丙酮—福尔马林固定液中固定30秒。PBS洗两次，每次5分钟，吹干。��

(二)酶免疫染色��

1.  三孔分别加McAb CD��3/CD��4/CD��8 20μl/孔，置湿盒37℃40—50分钟。PBS洗三次，每次5分钟，吹干。

2.  加HRP—羊抗鼠IgG，每孔20μl，置湿盒30—45分钟，冲洗同上。

3.  加底物液显色约30分钟，显微镜下控制显色时间，(显色较深时方可终止反应)用水冲洗，干燥。

4.  Maryer's苏木素复染10—30秒，(不可过长)流水冲洗，干燥。

四、结果��

加蒸馏水一滴，压盖玻片，高倍镜或油镜下进行细胞计数。凡细胞周边被染为褐色环者判为
阳性，至少计数200个细胞，计算其阳性率。��

阳性率（％）＝   阳性细胞数��×100％

淋巴细胞总数

正常值：CD3：60—70％；CD4：40—50％；CD8：20—30％��

五、注意事项��

(一)检测的血标本要新鲜，放置时间不宜过长(3—4小时)。��

(二)一份标本涂一张抗原片，同时检测CD3、CD4、CD8，要加单抗时及洗涤过程中难免“串门”，可将多份标本CD3、CD4、CD8集中于不同玻片上，并分缸洗涤。��

(三)Maryer's苏木素复染时间不宜过长，最好控制在10—20秒。

(四)显色要充分，显微镜下见细胞周围着色较深时方可。��

(五)本试剂盒所用HRP—羊抗鼠IgG因批号不同，其稀释度可能有差异。详见工作浓度。��

［附录］��

(一)丙酮—福尔马林固定液配制Na2 HPO4 20mg，KH2PO4 100mg，H2O2 30ml，丙酮45ml，福尔马林25ml，过滤，调pH至6.6，置4℃备用。��

(二)底物液配制：3.3′二氨基联苯二胺盐酸盐(DAB)60mg，PBS100ml，30％H2O2 30ml��

六、报告要求��

了解实验原理，报告检测结果。�お�

实验十四 淋巴细胞转化试验��

(Lymphocyte Transformation Test)

一、原理��

淋巴细胞在体外培养时，受到特异性抗原(如蛋白衍生物PPD，purified protein derivative)或非特异性有丝分裂原(如：PHA，ConA)刺激后，可转化成体积增大，代谢旺盛，蛋白与核酸合成增加，并能进行分裂的淋巴母细胞。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫功能水平。因此，淋巴细胞转化试验可做为测定机体细胞免疫功能的试验之一。临床上常作为某些疾病诊断，疗效判断、及估计预后的参考指标。��

二、材料��

(一)新鲜肝素抗凝血、植物血凝素(phytohemagglutihin，PHA)、细胞培养液、甲醇、瑞氏染液。��

(二)培养瓶、试管、滴管、玻片等。��

三、方法��

(一)采血��

取待检静脉血3.5毫升，注入含有肝素的抗凝管中(25μl/ml)，混匀。

(二)培养��

在盛有2.5毫升营养液的培养瓶中加入0.5毫升肝素抗凝血，同组共做四瓶。

(三)在上述两个培养瓶中，每瓶加入200微克PHA，做为试验管，其余两瓶不加PHA做为对照。

(四)将瓶塞塞紧，平置于37℃温箱中，培养三天，(于48小时后检查培养液酸碱度，用5％NaHCO3调节pH至7.2—7.4)。

(五)培养完毕，取出培养物移入试管，并用吸管吹打聚集成团的细胞，然后离心（1000rpm）5分钟，弃去上清液吸取白细胞层，置另一小试管中，用毛细吸管将细胞吹散，取一滴置于载玻片上，用载玻片均匀推开，待玻片干后，用甲醇固定5分钟，用瑞特氏染液染色。��

四、结果

每张片需观察头、体、尾三段，每段和纵列(目的是减少推片中细胞分布产生的误差)，每张计数200个以上细胞，计算淋巴细胞转化百分率。

 （一）细胞形态：

    ⑴淋巴母细胞：细胞体积明显增大，约12～20um，形态不整齐，核膜清楚，核染色质疏松呈细网状结构，核内可见1～4个核仁，胞浆崐变宽，核与胞浆比例变小，胞浆碱性明显增加，胞浆内可见小空泡，胞浆边缘可出现伪足。

    ⑵过渡型母细胞：为未完全转化的淋巴细胞，约12～16um，核染色质变疏松，有的见核仁，胞浆增多，嗜碱性增强。

    ⑶成熟淋巴细胞：与未经培养的外周循环中小淋巴细胞形态一致，其直径为6～8um，核染色质致密，无核仁，胞浆比核略大，轻度碱性。

    根据以上各细胞的形态，观察结果时⑴和⑵为转化细胞，⑶为未转化细胞。

                        转化的淋巴细胞数

   淋巴细胞化率＝────────────────×100％

                 转化的淋巴细胞＋未转化的淋巴细胞

    （二）正常值：正常情况下转化率为60─80％，但由于实验条件和操作技巧，可有一定出入。如为50—60％时偏低，50％以下则为降低。

五、注意事项��

(一)PHA用前必需测定转化反应的剂量。剂量太大，对细胞有毒性，剂量太小不足以刺激细胞转化。��

(二)实验条件应尽量固定，如改变条件，尤其营养液，PHA小牛血清等，在正式试验前，应进行预试。��

(三)试验中要求严格无菌操作，防止污染，否则由于细菌繁殖使培养液pH下降，细胞发育不良，影响细胞转化。��

六、报告要求��

绘图记录实验结果(未转化的和转化的淋巴细胞)�お�

�Κ� 

实验十五  动物过敏性休克��

(Anaphylactic Shock of Animal)

一、原理��

动物过敏反应，是预先给动物注射少量异种蛋白，经过一定的潜伏期，动物体内可产生特异性IgE类抗体，结合于肥大细胞及嗜碱性粒细胞表面的FcεR I，使机体处于致敏状态。当再次以较大量相同抗原注射后，多价变应原与致敏靶细胞上两个或两个以上相邻IgE的可边区结合，发生FcεRI交联，细胞活化，释放并合成大量生物活性介质，作用于效应组织和器官，动物可很快地产生严重的过敏性休克的症状。这种反应具有严格的特异性，只在大量注入同一致敏原时才能发生，用同种抗原小量多次注射可使动物脱敏。通过实验进一步加深Ⅰ型超敏反应机理的理解，提高对防治青霉素等药物过敏反应重要性的认识。��

二、材料��

(一)动物：健康豚鼠（150—250g）两只。��

(二)抗原：马（或牛、羊）血清。��

(三)无菌注射器及针头、碘酒精棉球等。��

三、方法��

(一)致敏注射��

取体重250克健康豚鼠甲、乙两只，甲豚鼠由皮下注射小牛血清0.1毫升致敏，乙豚鼠留作对照。��

(二)决定注射��

经2—3周后取甲、乙两只豚鼠由心脏注射牛血清1.5～2毫升。观察对比两者之反应。��

四、结果��

甲豚鼠可在注射后几分钟内有不安、前爪抓鼻、竖毛、咳嗽，继而产生全身抽搐，大小便失禁，最后因窒息而死亡。乙豚鼠安然无恙。��

五、注意事项��

(一)前后所用抗原相同。��

(二)决定注射时，应保证抗原物质注射入心脏内。��

六、报告要求��

结合超敏反应的理论，分析实验结果。��

实验十六 肥大细胞脱颗粒试验

（Degranulation of Mast cell）

一、原理��

肥大细胞包括结缔组织肥大细胞和黏膜肥大细胞，结缔组织肥大细胞分布于皮下小血管周围的结缔组织中，黏膜肥大细胞分布于黏膜下层。肥大细胞胞质中含有嗜碱性颗粒，储存有肝素、白三烯、组胺和嗜酸性粒细胞趋化因子等生物活性介质。肥大细胞表面具有IgE FcR I型（FcεR I），IgE可与之发生高亲和力结合，若再接触抗原，IgE与相应抗原发生结合，FcεRI交联，触发肥大细胞脱颗粒，释放生物活性介质，与I型超敏反应的发生有关。

二、材料

大白鼠1只

待测人血清

抗原液

EDTA的Hank＇s液

乙醚

玻片，吸管，棉球、显微镜、离心机等

三、方法

1．制备大鼠肥大细胞

将大鼠乙醚麻醉，心脏采血，分离血清备用。

给大鼠腹腔注射含EDTA的Hank＇s液15-20ml（EDTA浓度为0.5mg/ml）,轻揉腹部1分钟,切开小口,用毛细吸管吸出腹腔液,离心2000rpm，10分钟，弃上清液，沉在管底部的细胞用含大鼠自身血清Hank＇s液洗涤一次，（6mlHank＇s液加2ml自身血清），弃上清，将管底细胞悬于1ml含自身血清的Hank＇s液备用（应置冰浴保存）。取细胞悬液一滴于载玻片上，并盖上涂有中性红的盖片，在高倍镜下观察100个细胞（半小时内看完）。正常肥大细胞为圆形，边缘光滑，细胞膜内含有分布均匀的颗粒，如果细胞肿胀，边缘不整齐，颗粒自细胞内流出，即为脱颗粒，自身脱颗粒超过30%者则不宜用于正式试验。

2．正式试验

取上述细胞悬液1滴加于载玻片上，加待检病人血清一滴，混匀后放37℃孵育5分钟，使血清中IgE吸附于肥大细胞表面，再加变应原一滴（抗原原液或适当稀释），混匀37℃5分钟使变应原与肥大细胞表面IgE结合，使肥大细胞脱颗粒。盖上涂有中性红染液的盖片，用高倍镜检查，数100个细胞并计算其中脱颗粒细胞的百分率。

3．对照试验

抗原对照：细胞悬液1滴+抗原液1滴，混匀后37℃5分钟。

血清对照：细胞悬液1滴+患者血清1滴，混匀后37℃5分钟。

以上操作同正式试验，显微镜检查通常没有脱颗粒现象。

注意事项：制备和保存细胞悬液应尽量在冰浴中，以防细胞死亡。

附：中性红染液的配制：    中性红              125mg

无水乙醇            25ml

混匀溶解后保存备用。临用时再用无水乙醇稀释一倍，滴于清洁盖玻片上，在火焰上微加热。乙醇挥发后，染料即固定于盖玻片上。

四、结果

显微镜高倍镜下可见圆形或椭圆型肥大细胞，肥大细胞内大量红色颗粒。未脱颗粒细胞边缘光滑，胞内颗粒分布均匀且较多。脱颗粒细胞边缘不整齐，颗粒自细胞内流出，细胞肿胀。

对照试验显微镜检查通常没有或较少脱颗粒，若病人血清中含特异性IgE，脱颗粒肥大细胞数量增多。

五、注意事项

1．自身脱颗粒肥大细胞超过30%者不宜用于正式试验。

2．尽量去除大鼠体内血液，否则腹腔液中血细胞数量过多，影响观察。

3．制备和保存细胞悬液应尽量在冰浴中，尽可能短时间（半小时内）看完细胞，以防细胞死亡。

六、报告要求

肥大细胞脱颗粒实验的原理，分析实验结果。

实验十七 中性粒细胞的吞噬作用

(Phagocytosis of Neutrophils)

一、原理

吞噬细胞根据形态大小，可分为两类，大吞噬细胞是固定于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞，小吞噬细胞是在血液中的中性粒细胞。它们对外来异物有吞噬和消化功能，是机体天然防御的重要基础，测定吞噬功能，可以了解机体的免疫状态。中性粒细胞具有高度的移动性和吞噬功能，异物入侵时，中性粒细胞从血管渗出，游走到异物入侵局部，发挥吞噬、消灭异物的作用。

二、材料

(一)小白鼠，金黄色葡萄菌24小时肉汤培养物。

(二)无菌注射器及针头，解剖器械、玻片及瑞特氏染色液等。

三、方法

(一)在试验前24小时，将2％无菌淀粉液2毫升注射于小白鼠腹腔内。(二)在实验前4小时，再注入无菌生理盐水3毫升。��

(三)在实验前半小时，向小白鼠腹腔内注射葡萄球菌菌液0.3毫升。

(四)随即注入空气3毫升，手持小鼠上下翻转，以使菌液散开。

(五)每隔30分钟，吸取腹腔液涂片，做瑞氏染色。

(六)瑞氏染色法：

1．将瑞氏染色液滴加于涂片上，经１分钟，再加等量蒸馏水轻轻晃动混合或以口轻轻在近液面外吹气，使之混合，经５分钟。

2．用蒸馏水冲洗。

3．待干，或用吸墨纸吸干，镜检。

四、结果

随机计数100个中性粒细胞，分别计数吞噬细菌的中性粒细胞和所吞噬细菌总数，分别算出吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬百分率和吞噬指数高，表明机体的免疫力强，反之则低。正常人吞噬百分率6％左右，吞噬指数不小于1。

五、报告要求��

绘图记录中性粒细胞的吞噬现象。

实验十八 巨噬细胞的吞噬作用

(Phygocytosis of Macrophages)

一、原理

组织中的巨噬细胞可吞噬和杀灭多种病原微生物和处理衰老损伤的细胞，是机体非特异免疫的重要因素。巨噬细胞对颗粒性物质具有强大的吞噬功能，将待测巨噬细胞与吞噬颗粒（如鸡红细胞、白色念珠菌、酵母细胞等）混合温育一定时间后，颗粒物质可被巨噬细胞吞噬。根据吞噬百分率和吞噬指数可反映巨噬细胞的吞噬功能。

二、材料

(一)豚鼠、2％及5％淀粉、5％鸡红细胞悬液。

(二)无菌注射器及针头、玻片及瑞氏染液。

三、方法

(一)将2％淀粉或面粉煮沸成稀薄溶液，用注射器吸取6亳升注入豚鼠腹腔内。

(二)次日复注射5％淀粉6毫升。经1小时后，再于腹腔注入3毫升洗涤过的5％鸡红细胞悬液。

(三)注射血细胞后1小时，用注射器抽豚鼠腹腔渗出液滴于载玻片的一端1—2滴，制成推片，于空气中待其自干。用瑞氏染色法染色。

四、结果

观察腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，(鸡红细胞为有核的椭园形细胞，被吞噬于巨噬细胞的胞浆内)，吞噬率、吞噬指数计算如下。

�ふ�常参考值  吞噬百分率为62.77%±1.38%,吞噬指数为1.058±0.049。

五、注意事项

进行腹腔注射时，应注意不要过深，以免刺破肠管及膀胱。

六、报告要求

绘图记录巨噬细胞的吞噬现象。

实验十九间接免疫荧光法检测抗核抗体

免疫荧光技术是将已知的抗体（或抗原）分子标记上荧光素，再与相应的抗原（或抗体）结合，在荧光显微镜下可见到发荧光的抗原抗体反应，以此来检查相应的抗原（或抗体）是否存在的一种方法。由于它具有抗原抗体反应的特异性，标记技术的敏感性等，因此它已在免疫学、细菌学、病理学等基础理论研究以及临床快速诊断方面广泛应用。免疫荧光技术检测ANA包括鼠肝片法和短膜虫（Crifhidia Lueillia）法，本实验以鼠肝片法为例。

一、实验原理：

用小白鼠的肝脏印片或肝匀浆涂片，以此为基质片，加入标本血清，标本中的抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）与基质片中的细胞核抗原结合，再加入荧光素标记的二抗，在荧光显微镜下可见到发荧光的抗原抗体反应（抗原-抗体-荧光标记二抗），以此来检查标本中相应的抗核抗体。

二、试剂材料：

    1、0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。

    2、荧光标记的抗人免疫球蛋白抗体。

    3、95％乙醇。

    4、瑞氏染色液。

5、生理盐水。

6、荧光显微镜、37℃温箱、吹干机。

    7、立式染色缸、湿盒、研钵、试管、吸管、玻片、蜡笔等。

三、操作方法：

    （一）鼠肝片的制备：

    1．取小白鼠一只，断颈处死。取其肝脏剪成小块，用生理盐水洗去残血，放入钵体内研成均匀的组织浆。

    2．涂片：用玻璃棒取少量匀浆，在玻片上均匀涂成直径为0.5厘米左右的薄膜（不宜过厚），每片可涂四个，立即吹干。

    3．固定：将上述涂片放95％乙醇固定5分钟，吹干后密封于干燥容器放冰箱保存备用。

    4．瑞氏染色：取已固定的制片一张，瑞氏染色，观察涂片中胞核是否完整，如核完整并被染成蓝色时，其余涂片方可应用。

    （二）抗核抗体检测：

    1．将待检血清原液（或用生理盐水作1:8稀释）置 56℃水浴灭活30分钟。

    2．取鼠肝片一张，将所涂薄膜周围用蜡笔画一圆圈，组织膜上滴加灭活的待检血清一滴，置有盖湿盒中，平放于37℃温箱30分钟。

    3．取出玻片自来水冲洗后用0.01M， pH 7.2PBS浸泡5分钟，然后用自来水冲洗，共重复3次，吹干。

    4．滴加荧光标记的抗人球蛋白抗体（按工作浓度稀释）一滴，置37℃温箱30分钟。

    5．取出玻片略有自来水冲洗， 浸入0.01M，pH 7.2PBS中5分钟，自来水冲洗，重复3次，吹干。

    6．放荧光显微镜下观察结果。

    7．每次实验均需作下列对照：

    （1）阳性血清对照：阳性血清＋荧光抗抗体。

    （2）阴性血清对照：阴性血清＋荧光抗抗体。

    （3）荧光抗抗体对照：PBS缓冲盐水＋荧光抗抗体。

    8．发现阳性者，应将标本作1:2、1:4、1:8……稀释重做。

四、结果判断：

    荧光抗体对核的染色，可由于核抗原和相应的抗核抗体不同而观察到以下几种核染色形态：

    1．匀质型：是由抗DNP抗体所产生的核染色，整个细胞核呈现均匀一致的荧光染色。

    2．周边型：是由抗DNA抗体形成的核染色，表现为核周围的向外扩散呈绒毛状荧光染色，核区亮度较弱。

    3．颗粒状：是由抗可提取性核蛋白抗原的抗体（抗ENA抗体）所产生的核染色，在核的中央部分染色较浓，可见荧光斑点。

    4．核仁型：比较少见，是由抗核小体抗体所产生的染色，在核内可成点状荧光染色。

    阴性标本仅可见极淡绿色的非特异的荧光背景，有时还可见到与核形态大小相仿的空隙状暗区。

间接荧光法测抗核抗体以血清稀释度大于1:16阳性才有诊断价值，报告时应注明1比多少阳性。某些正常人（例孕妇及老人）也可出现阳性，但一般在1:5以下。

五、注意事项：

1．制备鼠肝涂片时，涂片不宜过厚。

2．应立即观察实验结果，否则荧光易猝灭。观察结果最好在暗室中。

3．先观察对照孔，特别是阴性对照应无非特异荧光。

六、报告要求：

   间接免疫荧光法检测抗核抗体实验原理。

实验二十酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法测甲胎蛋白（AFP）

一、实验原理

抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍保持其活性；抗原或抗体与酶交联成酶标抗原或抗体后，仍分别保持其免疫活性和酶活性。

酶标抗原或抗体与相应抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时，可以催化底物的水解、氧化或还原，从而产生有色物质。颜色反应的深浅与相应抗体或抗原量相关。

常用的ELISA方法包括：间接法、双抗体夹心法、竞争法等。

ELISA双抗体夹心法测AFP原理：用抗AFP抗体包被固相载体，加入待检标本，标本中的AFP与固相载体上的抗体结合，再加入酶标记的抗AFP抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，颜色的深浅与相应AFP的量呈正相关。

二、试剂材料

    1、抗AFP抗体。

    2、酶标的抗AFP抗体。

    3、AFP参考标准夜（0、20、50、100、200、400ng/ml）。

    4、洗涤缓冲液。

    5、底物溶液。

6、终止液（2M H2SO4）。

7、酶标测定仪、37℃温箱。

    8、微量加样器、吸管、滴管、待包被的反应板等。

三、操作方法：

（一）定量试验

    1．包被

    取已稀释好的抗AFP抗体加入待包被的反应板中，4℃冰箱过夜（包被时≥18h），第二天取出，用洗涤液洗涤3次，3分钟／次。玻璃纸封存，置4冰箱保存备用。

    2．加样

    取包被好的酶标板，按测定标本数剪下所需用的反应孔条进行标记，反应板第1－6孔分别加入AFP参考标准夜（0、20、50、100、200、400ng/ml）各100ul。其余各孔加入样品100ul。37℃45分钟。

    3．洗涤

    倾去液体，各孔内加满洗涤液洗涤3次，3分钟／次，吸干。

    4．加酶标抗体（HRP－抗人AFP抗体）应用液

    每孔加酶标抗体应用液100ul，37℃30分钟。

    5．洗涤

    同3。

    6．加底物溶液

每孔加入临时配制的酶底物溶液100ul，室温暗处避光显色20分钟，加入2M H2SO4 50ul终止反应。

（二）         定性试验

1．包被

同“定量试验”。

2．加样

取包被好的酶标板3各孔，分别加入阴性对照（20 ng/ml）、阳性对照（400 ng/ml）、和待检标本各100ul，37℃45分钟。

其余步骤同“定量试验”。

四、结果判断

    1．定量试验

用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长420nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值，以OD值为横坐标，AFP含量为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的OD值在标准曲线上查出相应标本的AFP含量。

2．定性试验

在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔色泽深于阳性对照孔则AFP＞400ng/ml；若待检样品孔色泽深于阴性对照孔而浅于阳性对照孔则20ng/ml＜AFP＜400ng/ml。

    参考范围：正常成人AFP含量＜20ng/ml。

五、注意事项

1．使用器械必须清洁，蒸馏水应新鲜制备。

2．洗涤时应严格按操作说明进行。每次吸除液体应注意吸干。

3．各试剂配制时与使用前均要充分混匀。

4．试剂盒内容物严禁与其它批号试剂盒混用。

5．标本应新鲜采集，无溶血。

6．保温过程最好用恒温水浴箱。

六、报告要求

1．简述ELISA原理及ELISA双抗体夹心法测AFP原理。

2．绘制标准曲线记录实验结果。

实验二十一免疫层析实验（immunochromatographic assay，ICA）

一、实验原理

ICA是新近发展起来的另一种固相免疫测定。ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般。移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域的抗原或抗体结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物的显色来判定试验结果。以胶体金为标记物的试验称为金免疫层析试验（GICA）。ICA中所用的试剂全部为干试剂，它们被组合在一试剂条上。以双抗体夹心法测HCG为例。

 

A  G       T  C  B

A：样本垫：吸水材料，加样本处

G：结合垫：金标记抗αHCG干燥固定在吸水材料上

T：检测区：包被抗βHCG      

C：参照区：包被抗鼠IgG抗体   

B：吸水垫。

二、试剂材料

    金免疫层析试剂条

三、操作方法

1．沿铝箔袋切口部位撕开，取出试剂条。将试剂条A端浸入尿液中，至少3秒钟后取出平放，5分钟内观察显示结果。

2．通过层析作用，尿液从A端向B端移动，流经G区时将金标记抗αHCG复溶，若尿液中含HCG，即形成金抗αHCG-HCG复合物；

3．移行至T区，形成金抗αHCG-HCG-抗βHCG复合物，在T区显示红色线条，为阳性反应。

4．多余的金标记抗αHCG移行至C区时被抗小鼠IgG抗体捕获，而显示出红色对照线条。

5．如尿液中不含HCG，在T区不出现红色线条，仅在C区出现红色线条，试验结果为阴性。

6．如C区无红色线条出现，表示试验无效。

四、结果判断

  阳性：在检测线位置及对照线位置各出现一条红色反应线。

  阴性：仅在对照线位置出现一条红色反应线。

  无效：测试纸无红色反应线出现，或仅在检测线位置出现一条红色反应线，表明实验失败或检测试纸失效。请用新测试纸重试。

五、注意事项

   1．待测样品、检测试纸或其他检测用材料等均在室温平衡。

   2．测试纸插入尿液深度不可超过MAX标志线。

   3．室温（4~30℃）避光密封干燥储存，切勿冰冻。

六、报告要求

金免疫层析试验双抗体夹心法测HCG原理。

实验二十二 血清三碘甲状腺原氨酸（T3）放射免疫测定

一、实验原理

放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是将同位索标记技术与抗原抗体反应相结合的一种微量分析方法。基本原理是同位素标记抗原（*Ag）和待测标本中未标记抗原（Ag）在抗原过量的情况下，对专一抗体的竞争结合。

    在上述反应系统中，当*Ag(标记抗原)和Ab (专一抗体)的量是固定的，则*Ag—Ab复合物的形成是受Ag含量所制约的。如样品中的Ag含量高，则Ag对专一抗体（Ab）的竞争能力强。Ag-Ab复合物的形成量就增多，*Ag-Ab复合物的形成量相对减少；反之，如Ag的含量低，则Ag对专一抗体（Ab）的竞争能力弱，*Ag-Ab复合物的形成量就增多。因此，*Ag-Ab复合物的形成量与Ag的含量呈一定的逆相关函数关系。通常先以各种已知浓度的抗原和一定量的标记抗原及其抗体作用，即可测得在各种标准抗原浓度下*Ag-Ab的放射性结合率，以此绘制竞争抑制标准曲线。标准曲线又称剂量反应曲线（dose-response curve）或标定曲线（calibration curve）。根据待测抗原的放射性结合率，可查出该抗原含量。以RIA检测三碘甲状腺原氨酸（T3）为例。

二、试剂材料

    1．标准T3溶液：将标准品分别加入0.5ml蒸馏水溶解。溶解15分钟后，摇匀使用。溶解后浓度分别为：0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ng／ml。

    2．125I─T3溶液：加样前摇匀。

    3．T3抗血清：加10ml蒸馏水溶解，使用时摇匀。

    试剂溶液均保存在2─8℃条件下。

4．分离剂（固相第二抗体）：加样前必须摇匀。

5．聚苯乙烯塑料试管（1×7cm）。

    6．r-计数器

三、操作方法

取聚苯乙烯管若干，用记号笔或玻璃蜡笔标上记号NSB（nonspecific binding）、S0～S5和待测样品管等，然后用微量加样器按下表加样。

（u1）

摇匀室温放置15分钟，3500rpm离心20分钟，弃上清，测各管沉淀的放射性（cpm）

四、结果判断：

1．计算结合百分离，结合百分离按下式计算：

                    S1－S5(cpm)－NSB(cpm)

     B/Bo百分率＝───────────×100％

So(cpm)－NSB(cpm)

2．绘制标准曲线：

以B/Bo百分率为纵座标，以T3标准浓度为横座标在半对数座标纸绘画出标准曲线。根据待测样品B/Bo百分率，可以从标准曲线上查得样品的T3含量。

参考值：0.9 ~ 2.2ng/ml

五、注意事项

1．冰干品溶解后应保存2 ~ 8℃条件下，不要反复冰融。否则活性下降。

2．所有试剂包括待测样品，分析前应在室温下平衡。在加分离试剂前，须充分摇匀。

3．固相二抗不得冷冻。

4．125I-T3溶液应避光保存。操作中应注意防护。废弃物应按国家有关规定存放。

5．严重溶血标本不能用；脂血会使结果偏高，宜空腹采血。

六、报告要求

放射免疫测定血清三碘甲状腺原氨酸（T3）的原理。

实验二十三可提取性核抗原（ENA）自身抗体检测－Western Blot法

一、实验原理

Western Blot法又称免疫印迹法（IBT），分三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见。第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。

二、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

（一）试剂材料

1．30％凝胶贮备液：含29％（W/V）丙烯酰胺

2．1％（W/V）N，N－亚甲双丙烯酰胺：用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中。

3．10％SDS，去离子水配制，贮存于室温中

4．TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙烯二胺）

5．10％过硫酸胺：用无离子水配制少量，最多4℃贮存一周；

6．Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

    7．样品缓冲液

8．ENA：用PH7.4 0.01M PBS从牛胸腺丙酮粉中抽提，浓度为5mg/ml，－70℃保存备用。

9．垂直电泳槽、电泳仪、稳压器、微量加样器、滴头、EP管、吸管等。

（二）实验方法

    1．准备玻璃板，依次用水，10％SDS，H2O，乙醇和水冲洗，干燥。

    2．配制分离胶：总量40ml，其中：

           水  13.2ml

           30％丙烯酰胺溶液16.0ml

           1.5mol/L Tris(PH8.8) 10.0ml

           10％SDS    0.4ml

           10％过硫酸铵  0.4ml

           TEMED  0.016ml

    3．配制浓缩胶：总量8ml，其中：

           水  5.5ml

           30％丙烯酰胺溶液  1.3ml

           1.0mol/L Tris(PH6.8)  1.0ml

           10％SDS        0.08ml

           10％过硫酸铵   0.08ml

           TEMED         0.008ml

    将配制好的浓缩胶注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。

    4．加样。将ENA及蛋白标准加入梳孔内。

    5．电泳。开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。

6．取下凝胶，固定、染色或进行Western blot等实验。

三、蛋白蛋从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜

（一）试剂材料：

1．  移缓冲液

2．  移电泳槽、电泳仪、稳压器。

3．  硝酸纤维素膜纤维素滤膜、Whatman3MM滤纸、海绵等。

（二）操作方法：

     1．剪6块3MM滤纸和一块硝酸纤维素膜，其大小应与SDS－凝胶的大小相同。如果纸或膜比凝胶大，在转移过程中会形成短路。这将影响蛋白质的转移。

     2．将剪好的3MM滤纸及纤维素膜在转移缓冲液中浸泡3－5分钟。

     3．按下列过程安装转移装置：

    （1）将塑料支架平放在含有转移缓冲液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵。

    （2）将3块3MM滤纸对齐放在海绵上，依次放置纤维素膜，凝胶。另外3块3MM滤纸及海绵。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡，若有气泡残留，则影响转移效果。

    （3）最后用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，注意纤维素膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。

     4．接通电源，电压40V电流0.17－0.2A，转移1.5－6小时，转移时间可根据靶蛋白的大小来定，蛋白质分子量小则需时短，蛋白质分子量大需时长。

     5．转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，用铅笔在膜的上缘作好标记，切下其中一个孔所对应膜的1/2，用氨基黑染色30秒，10％乙酸脱色，检查转移是否完全；也可将转移后的凝胶作考马斯亮蓝染色来检查转移效果。

     6．将其余的纤维素放在一张干净的3MM滤纸上，室温下干燥30－60分钟。

四、ENA自身抗体检测

（一）试剂材料：

    1．洗涤液：含0.05％吐温－20的PH7.4的PBS

    2．酶标抗人IgG

    3．阴性对照血清、阳性对照血清

    4．底物溶液

    5．终止液

    6．已转印有ENA的硝酸纤维素（NC）滤膜条。

7．恒温摇床、微量加样器、反应槽、塑料袋、滴管、吸管等。

      （二）操作方法：

    1．切下数条已转印有ENA的NC滤膜。

    2．封闭（用10％的牛血清白蛋白37℃浸泡1小时）。

    3．洗涤液漂洗5次，每次1分。

    4．加样。1ml洗涤液加入20μl血清，37℃恒温摇动1小时。

    5．洗涤液漂洗5次，每次1分。

    6．加入1ml酶标羊抗人IgG，37℃恒温摇动1小时。

    7．洗涤液漂洗5次，每次1分。

    8．加入底物液1ml，显色10分钟。

9．加入终止液终止反应。 

（三）结果判断：

    用肉眼观察。阴性对照槽应没有条带，阳性对照槽出现多个条带，不同的疾病可以出现不同的条带。跟据条带位置判断结果。

    判断标准

    1．抗Sm抗体：同时出现29KD、28KD、13.5KD条带。

    2．抗SSA抗体：60KD、52KD任意出现一条带。

    3．抗SSB抗体：47KD、45KD应用时出现条带。

    4．抗Jo-1抗体：55KD出现条带。

5．抗Scl-70抗体：同时出现86KD、67KD条带。

五、注意事项：

    1．丙烯酰胺与N,N-亚甲基双丙烯酰胺是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应避免与皮肤接触。

2．过硫酸铵溶液最好当天配制，冰箱中储存也不能超过1周。

3．遇有转印效果不佳时，注意调整转印固定装置，以使凝胶与NC膜密切接触；降低凝胶浓度或交联度；延长转印时间或提高转印压力；改变缓冲液p H等。

4．若NC膜经酶免疫测定后，背景着色较深，可增加封闭液浓度、延长封闭时间或提高温度；延长洗涤时间或增加洗涤次数。

5．作酶免疫测定时应选用特异性高的抗体，注意酶免疫测定过程中可能会出现的问题。

六、报告要求：

免疫印迹法（IBT）检测可提取性核抗原（ENA）自身抗体的原理。