实验5_旋光度的测定与薄层色谱分析

实验5 旋光度的测定与薄层色谱分析

一、实验目的

1．学习测定旋光性溶液的旋光度。熟悉旋光物质的旋光现象。

2．掌握薄层色谱的基本原理，学会用薄层色谱法来跟踪有机反应。

二、实验原理

（一）旋光度的测定原理

1．偏振光的基本概念

请看有机化学教材相关章节。

2.旋光现象

图1. 旋光现象示图（1. 起偏器 2. 起偏器偏振化方向 3. 旋光物质 4. 检偏器偏振化方向 5. 旋光角 6. 检偏器）

偏振光通过某些晶体或某些物质的溶液以后，偏振光的振动面将旋转一定的角度，这种现象称为旋光现象。如图1所示，这个角称为旋光度，它与偏振光通过溶液的长度L和溶液中旋光性物质的浓度C成正比，即

(2)

式中称为该物质的率（比旋光度）。如果L的单位用dm，浓度C定义为在1cm³溶液内溶质的克数，单位用g／cm³，那么旋光率的单位为（º）cm³／(dm·g)。

实验表明，同一旋光物质对不同波长的光有不同的旋光率。因此，通常采用钠黄光(589.3nm)来测定旋光率。旋光率还与旋光物质的温度有关。.如对于蔗糖水溶液，在室温条件下温度每升高(或降低)1℃，其旋光率约减小(或增加)0.024ºcm³／(dm·g)。因此，对于所测物质的旋光率，必须说明测量时的温度。旋光率还有正负，这是因为迎着射来的光线看去，如果旋光现象使振动面向右(顺时针方向)旋转，这种溶液称为右旋溶液，如天然的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的水溶液，它们的旋光率用正值表示。反之，如果振动面向左(逆时针方向)旋转，这种溶液称为左旋溶液，如转化糖、果糖的水溶液，它们的旋光率用负值表示。严格来讲旋光率还与溶液浓度有关，在要求不高的情况下，此项影响可以忽略。

若已知待测旋光性溶液的浓度C和液柱的长度L，测出旋光角，就可以由(2)式算出旋光率。也可以在液柱长L不变的条件下，依次改变浓度C，测出相应的旋光角，然后画出与C的关系图线(称为旋光曲线)。它基本是条直线，直线的斜率为，由直线的斜率也可求出旋光率。反之，在已知某种溶液的旋光曲线时，只要测量出溶液的旋光角，就可以从旋光曲线上查出对应的浓度。

（二）WXG―4型旋光光度仪的结构及工作原理（进实验室后听老师具体讲解）

用WXG―4型旋光仪来测量旋光性溶液的旋光角，其结构如图2所示。为了准确地测定旋光角，仪器的读数装置采用双游标读数，以消除度盘的偏心差.度盘等分360格，分度值，角游标的分度数n=20。因此，角游标的分度值i=／n=0.05º，与20分游标卡尺的读数方法相似，度盘和检偏镜联结成一体，利用度盘转动手轮作粗(小轮)、细(大轮)调节，游标窗前装有供读游标用的放大镜。

仪器还在视场中采用了半荫法比较两束光的亮度，其原理是在起偏镜后面加一块石英晶体片，石英片和起偏镜的中部在视场中重叠，将视场分为三部分。并在石英片旁边装上一定厚度的玻璃片，以补偿由于石英片的吸收而发生的光亮度变化，石英片的光轴平行于自身表

图2. WXG―4型旋光仪结构（1. 钠光灯 2. 毛玻璃片 3. 会聚透镜 4. 滤色镜 5. 起偏镜 6. 石英片 7. 测试管端螺帽 8. 测试管 9. 测试管凸起部分 10. 检偏镜 11. 望远镜物镜 12. 度盘和游标 13. 望远镜调焦手轮 14. 望远镜目镜 15. 游标读数放大镜 16. 度盘转盘细调手轮 17. 度盘转盘粗调手轮）

面并与起偏镜的偏振化方向夹一小角(称影荫角)，由光源发出的光经过起偏镜后变成偏振光，其中一部分再经过石英片，石英是各向异性晶体，光线通过它将发生双折射。可以证明，厚度适当的石英片会使穿过它的偏振光的振动面转过角，这样进入测试管的光是振动面间的夹角为的两束偏振光。

在图3中, OP表示通过起偏镜后的光矢量，而OP´则表示通过起偏镜与石英片后的偏振光的光矢量。OA表示检偏镜的偏振化方向，OP和OP´与OA的夹角分别为β和β'，OP和OP´在OA轴上的分量分别为。转动检偏镜时，的大小将发生变化。

于是从目镜中所看到的三分视场的明暗也将发生变化(见图3的下半部分)。图中画出了四种不同的情形：

图3 旋光仪的三分视场图

(1)：从目镜观察到三分视场中与石英片对应的中部为暗区，与起偏镜直接对应的两侧为亮区，三分视场很清晰。当时，亮区与暗区的反差最大。

(2) ：三分视场消失，整个视场为较暗的黄色。

(3) ：视场又分为三部分，与石英片对应的中部为亮区，与起偏镜直接对应的两侧为暗区。当时，亮区与暗区的反差最大。

(4) ：三分视场消失。由于此时OP和OP´在OA轴上的分量比第二种情形时大，因此整个视场为较亮的黄色。

由于在亮度较弱的情况下，人眼辨别亮度微小变化的能力较强，所以取图3 (2)情形的视场为参考视场，并将此时检偏镜偏振化方向所在的位置取作度盘的零点。

实验时，将旋光性溶液注入已知长度L的测试管中，把测试管放入旋光仪的试管筒内，这时OP和OP´两束线偏振光均通过测试管，它们的振动面都转过相同的角度，并保持两振动面间的夹角为不变.转动检偏镜使视场再次回到图3(2)状态，则检偏镜所转过的角度就是被测溶液的旋光角。

（三）薄层色谱分析原理与应用

薄层色谱可以分为：吸附色谱和分配色谱（主要介绍固－液吸附色谱），只不过固体吸附剂是在玻璃板或硬质塑料板上铺成均匀的薄层（约0.25～l mm），用毛细管将样品点在板的一端，把板放在合适的流动相（展开剂）里。流动相带着混合物组分以不同的速率沿板移动，即组分被吸附剂不断地吸附，又被流动相不断地溶解——解吸而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相也有不同的解吸能力。因此。在流动相向前移动的过程中，不同的组分移动不同的距离而形成了互相分离的斑点。在给定条件下（吸附剂、展开剂的选择，薄层厚度及均匀度等），化合物移动的距离与展开剂前沿移动的距离之比值（R_f值）是给定化合物特有的常数。即：

R_f 也称比移值，表示物质移动的相对距离，即样品点到原点的距离和溶剂前沿到原点的距离之比，常用分数表示。R_f 值与化合物的结构、薄层板上的吸附剂、展开剂、显色方法和温度等因数有关。但在上述条件固定的情况下，R_f值对每一种化合物来说是一个特定的数值。当两个化合物具有相同的R_f值时，在未做进一步的分析之前不能确定它们是不是同一个化合物。在这种情况下，简单的方法是使用不同的溶剂或混合溶剂来作进一步的检验。

图4. R_f值计算示意图

1.起点线； 2.展开剂前沿；

a.色斑最高浓度中心至原点中心的距离；b.展开剂前沿至原点中心的距离

薄层色谱的特点是：①设备简单，操作容易；②分离时间短，只需数分钟到几小时即可得到结果，因而常用来跟踪有机反应，监测有机反应完成的程度；③分离能小，斑点集中，特别适用于挥发性小、或在高温下易发生变化而不能用气相色谱分离的物质；④可采用腐蚀性的显色剂如浓硫酸，且可在较高温度下显色；⑤不仅适用于小量样品（几毫克）的分离，也适用于较大量样品的精制（可达500毫克）。应该指出，薄层色谱是否成功，与样品、使用的吸附剂、展开剂以及薄层的厚度等因素有关。

　1．吸附剂的选择

薄层色谱中常用的吸附剂（固定相）和柱色谱一样有氧化铝、硅胶等，只不过要求的颗粒更细（一般约200目左右）。颗粒太大，展开速度太快，分离效果不好；颗粒太细，展开时又太慢，可能会造成拖尾、斑点不集中等。由于用于薄层色谱的吸附剂颗粒较细，所以分离效率比相同长度的柱效率高得多。一般展开距离在10～15厘米的薄层比展开距离在40～50厘米的滤纸效率还高。斑点也比纸色谱的小。吸附剂常和少量粘合剂（如羧甲基纤维素钠，简称CMC－钠、煅石膏2CaSO₄·H₂O、淀粉等）混合，以增大吸附剂在板上的粘着力。于是薄层板分为两种：通常将加粘合剂的薄层板称为硬板，不加粘合剂的板称为软板。大致说来，薄层用的硅胶类型分为硅胶H，不加粘合剂；硅胶G，含煅石膏作粘合剂；硅胶H₂₅₄，含荧光物质，可于波长254纳米紫外光下观察荧光；硅胶GF₂₅₄，含煅石膏又含荧光剂。氧化铝也因含粘合剂和荧光物质分为氧化铝G、氧化铝GF₂₅₄及氧化铝HF₂₅₄等。

薄层吸附色谱和柱吸附色谱一样，所使用的吸附剂对分析样品的吸附能力和样品的极性有关。极性大的化合物吸附性强，因而R_f值就小。因此利用硅胶或氧化铝薄层可将不同极性的化合物分离开来。

2．展开剂的选择

薄层吸附色谱展开剂的选择与吸附柱色谱洗脱剂的选择相同，极性大的化合物需用极性大的展开剂，极性小的展开剂用以展开极性小的化合物。一般情况下，先选用单一展开剂如苯、氯仿、乙醇等，若发现样品各组分的比移值较大．可玫用或加入适量极性较小的屣开剂如石油眯等。反之．若样品各组分的比移值较小，则可加入适量极性较大的展开剂试行展开。在实际工作中，常用两种或三种溶剂的混合物作展开剂，这样更有利于调配展开剂咸极性，改善分离效果。通常希望Rf值在0.2～0.8范围内，最理想的Rf值在0.4～0.5之间。

在此过程中，选择合适的展开剂是至关重要的。一般展开剂的选择与柱色谱中洗脱剂的选择类似，即极性化合物选择极性展开剂，非极性化合物选择非极性展开剂。当一种展开剂不能将样品分离时，可选用混合展开剂。常见溶剂在硅胶板上的展开能力为：戊烷、四氯化碳、苯、氯仿、二氯化碳、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等依此增强。一般展开能力与溶剂的极性成正比。混合展开剂的选择请参考柱色谱中洗脱剂的选择。

3．薄层板的制备(略)

4．薄层板的活化

薄层板经过自然干燥后，再放入烘箱中活化，进一步除去水分。不同的吸附剂及配方，需要不同的活化条件。例如：硅胶一般在烘箱中逐渐升温，在105～110℃下，加热30min；氧化铝在200～220℃下烘干4h可得到活性为II级的薄层板，在150～160℃下烘干4h可得到活性为III～IV级的薄层板。当分离某些易吸附的化合物时，可不用活化。

5．点样

将样品用易挥发溶剂配成1%～5%的溶液。在距薄层板的一端10mm处，用铅笔轻画一条横线作为点样时的起点线，在距薄层板的另一端5mm处，再画一条横线作为展开剂向上爬行的终点线（划线时不能将薄层板表面破坏）。

用内径小于1mm干净并且干燥的毛细管吸取少量的样品，轻轻触及薄层板的起点线（点样），然后立即抬起，待溶剂挥发后，再触及第二次。这样点3～5次即可，如果样度浓度低可多点几次。在点样时应做到“少量多次”，即每次点的样品量要少一些，点的次数可以多一些，这样可以保证样品点即有足够的浓度点又小。点好样品的薄层板待溶剂后再放入展开缸中进行展开。

6．展开

展开时，在展开缸中注入配好的展开剂，将薄层板点有样品的一端放入展开剂中（注意展开剂液面的高度应低于样品斑点）。在展开过程中，样品斑点随着展开剂向上迁移，当展开剂前沿至薄层板上边的终点线时，立刻取出薄层板。将薄层板上分开的样品点用铅笔圈好，计算比移值。

7．比移值－R_f的计算

某种化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升高度的比值称为该化合物的比移值，常用Rf来表示：

对于一种化合物，当展开条件相同时，R_f值是一个常数。因此，可用Rf作为定性分析的依据。但是，由于影响凡值的因素较多，如展开剂、吸附剂、薄层板的厚度、温度等均能影响凡值，因此同一化合物的R_f值与文献值会相差很大。在实验中我们常采用的方法是，在一块板上同时点一个已知物和一个未知物，进行展开，通过计算R_f值来确定是否为同一化合物。

8．显色

样品展开后，如果本身带有颜色，可直接看到斑点的位置。但是，大多数有机化合物是无色的，因此，就存在显色的问题。常用的显色方法有：

①显色剂法常用的显色剂有碘和三氯化铁水溶液等。许多有机化合物能与碘生成棕色或黄色的络合物。利用这一性质，在一密闭容器中（一般用展开缸即可）放几粒碘，将展开并干燥的薄层板放人其中，稍稍加热，让碘升华，当样品与碘蒸气反应后，薄层板上的样品点处即可显示出黄色或棕色斑点，取出薄层板用铅笔将点圈好即可。除饱和烃和卤代烃外，均可采用此方法。三氯化铁溶液可用于带有酚羟基化合物的显色。

②紫外光显色法用硅胶GF₂₅₄制成的薄层板，由于加入了荧光剂，在254 nm波长的紫外灯下，可观察到暗色斑点，此斑点就是样品点。

三、实验用试剂药品与仪器装置

试剂药品：四种不同浓度的葡萄糖溶液，未知浓度的葡萄糖溶液，蒸馏水，2个待点样液等。

仪器装置：旋光仪，擦镜纸，滴管，层析缸, 试管，紫外灯，点样毛细管等。

四、实验步骤

（一）旋光度的测定

1．调整旋光仪，校验零点位置

2. 测定旋光性溶液的旋光率和浓度

(1). 测四种已知浓度的葡萄糖溶液旋光度。

(2). 调节望远镜调焦手轮，使三分视场清晰，调节度盘转动手轮，在视场中找到三分视场刚消失并且整个视场变为较暗的黄色时的左、右两游标的读数即为该溶液旋光度（进实验室后听老师具体讲解）。

(3). 测出四种不同浓度葡萄糖溶液的旋光角后，在坐标纸上根据作图法规则，绘出―C图线。根据图解法规则，由图线的斜率求出该物质的旋光率，在图线旁边应标明实验时溶液的温度和所用的光波波长。

(4). 将浓度未知的葡萄糖溶液装入测试管，测出旋光角，再从―C图线上确定待测液体的浓度。

（二）薄层色谱实验

在同一个薄层层析板上，对2个极性不同的待点样液（a、b）和二者的混合液进行薄层色谱分析，用乙酸乙酯和石油醚混合溶剂做展开剂，调整二者比例以达到最佳分离效果。计算a、b 样品的R_f 值。要求在原始记录中画出板的真实展开情况。

五、注意事项

1. 测试管应轻拿轻放，小心打碎。

2. 所有镜片，包括测试管两头的护片玻璃都不能用手直接揩拭，应用柔软的绒布或镜头纸揩拭。

3. 只能在同一方向转动度盘手轮时读取始、末示值，决定旋光角，而不能在来回转动度盘手轮时读取示值，以免产生回程误差。

4.点样：画线时不能将板划破，点样斑点直径小于2mm，斑间距1～1.5 cm，标准左样品右,点样结束干燥后再进行下一步。　　

5. 展开：一般原则：根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素考虑。溶剂的极性越大对样品的洗脱力越强。层析缸中的溶剂一般为 2~3 mm 高。若无层析缸，可用小烧杯盖上玻璃板代替。

思考题

1．用新配制的葡萄糖溶液测旋光度时会出现什么现象？

2. 展开剂的极性选择如何影响薄层色谱的效率？

板书内容：实验5 旋光度的测定与薄层色谱分析

一、实验目的

1．学习测定旋光性溶液的旋光度。熟悉旋光物质的旋光现象。

2．掌握薄层色谱的基本原理，学会用薄层色谱法来跟踪有机反应。

二、实验原理

（一）旋光度的测定原理

1. 旋光现象、比旋光度（旋光率）

偏振光通过某些晶体或某些物质的溶液以后，偏振光的振动面将旋转一定的角度，这种现象称为旋光现象。

式中称为该物质的比旋光度（旋光率）。L为旋光管长度，单位用dm，浓度C为在1cm³溶液内溶质的克数，单位用g／cm³，旋光率的单位为（º）cm³／(dm·g)。

同一旋光物质对不同波长的光有不同的旋光率。通常采用钠黄光(589.3nm)来测定旋光率。旋光率还与旋光物质的温度有关。故常用[α]^t_λ 来表示。

2. 旋光度测定方法

目镜中所看到的三分视场，当三分视场刚消失并且整个视场变为较暗的黄色时（图2），记录下左、右两游标的读数，即为旋光度。

（二）薄层色谱分析原理与应用

= a/b

1.起点线； 2.展开剂前沿

1．吸附剂的选择: 氧化铝、硅胶等

2．薄层板的制备

3．薄层板的活化

4．点样

5．展开(展开剂的选择)

6．比移值－R_f的计算

7．显色