免疫电泳实验报告

分子免疫学实验报告

免疫电泳实验报告

摘要 :本实验运用火箭电泳、微量电泳、双向免疫扩散等方法测定抗体的效价。

关键词 :抗体效价测定 ; 火箭电泳 ; 微量电泳; 双向免疫扩散

1 前言

免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法很多,主要有单向免疫扩散、双向扩散电泳、对流免

疫电泳、微量免疫电泳、免疫火箭电泳、免疫固定电泳等几种方法。其中比较常用方法有以下三

种。

火箭免疫(rocket immunoelectrophoresis),该方法是在琼脂板内掺入适量的抗体,在电场的

作用下定量的在含适量抗体的离子琼脂中泳动,当走在前面的抗原遭到琼脂板内的抗体时,形成

抗原体复合物而沉淀出来,走在后面的抗原继续在电场的作用下向正极泳动,在向前泳动过程中,

遇到了前面抗原所沉淀的抗原抗体复合物,由于抗原的增加造成抗原过量时复合物沉淀溶解,并

一同向正极移动而进入新的琼脂板内与未结合的抗体结合,有形成新的抗原抗体复合物沉淀出

来,这样不断地沉淀—溶解—再沉淀,直到全部抗原与抗体结合,当比例合适时,可在短时间内

出现锥形沉淀线,此沉淀线形似火箭,故称火箭电泳,抗原含量越高所形成的火箭峰愈长,因此

依据火箭峰的长度,与标准抗原比较精确地计算抗原的浓。

微量电泳,该方法的原理是不同蛋白质颗粒所带电荷不同,在同一电场中,因泳动速度不同

而发生分离,用于抗原、抗体纯度测定,以及临床诊断。

双向免疫扩散(double immunodiffuison),根据出现沉淀线时抗体的最高稀释度来计算抗

体的效价,或者依据沉淀线的出现定性抗原,检测疾病。

2 材料与方法

2.1 材料 抗体,抗原,巴比妥钠-HCl缓冲液(pH8.6,0.4M),1.5%琼脂糖凝胶,7%醋酸,

电泳仪,温箱,玻璃板,打孔器等。

2.2 方法

2.2.1 火箭电泳法 配制巴比妥钠-HCl缓冲液(pH8.6,0.4M);制备1.5%琼脂糖凝胶,煮

沸至完全溶解;取琼脂糖凝胶约15ml,置55 ?C水浴中降温,并加入抗体 200μL,共同孵育;

将二者混匀,铺火箭电泳板,放置冷凝倍比稀释抗原抗体;电泳板打孔(6孔),加入已稀释的抗

原 (约10 μL/孔 );电泳3~4h, 电流:30mA/块, 电压:100~120V;待火箭电泳结束,用

0.1%氨基黑染色10min,7%醋酸脱色至条带清晰。

2.2.2 微量电泳法 用移液管取煮沸的琼脂糖凝胶铺板(7.5×2.5cm),共2块,每块约铺

3ml凝胶(双扩同样方法,铺3块);给微量电泳板打抗圆孔、抗体槽,并在抗原孔内分别加入阳

性抗原和阴性抗原(约10μL);电泳约40~60min , (电压:4~6V/cm;电流:1~5mA/cm);电泳结束后,取出抗体槽的凝胶,加入15 μL抗体,置

37 ?C温箱过夜。

2.2.3 双向免疫扩散法 铺2块板,同微量电泳;给双扩板打孔(梅花形),每板打2组,一

块板中央孔加入未稀释的抗原,每组周围6孔加入倍比稀释的抗体;置于37 ?C温箱孵育24~48hr,

测定抗体效价;另一块板中央孔加入未稀释的抗原,每组周围6孔加入倍比稀释的抗体。置于

37 ?C温箱孵育24~48hr,测定抗原效价。

3 结果

3.1 火箭电泳法 表:抗原浓度对应的电泳峰值(cm)

Ag(x)

峰值(cm) 1 1.75 0.5 1.55 0.25 1.4

0.125 1.35 0.06125 0.030625 1 0.87

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分子免疫学实验报告

3.2 微量电泳法 实验结果表明,1/16抗原孔出现沉淀弧,说明了抗原在此浓度下与抗体反应最为敏感。

3.2 双向免疫扩散法 实验结果表明靠阴性抗原处出现沉淀弧,表明了阴性抗原与抗体反应最为敏感。

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第二篇:对流免疫电泳

对流免疫电泳

(一)原理

将抗原和抗体分别加入半固体琼脂孔内,在碱性缓冲液中进行电泳时,蛋白质抗原带负电荷,在电场中由阴极向阳极移动。抗体等电点较抗原高,在此缓冲液中带阴离子少,分子量大,泳动较慢,同时因电渗作用(电渗是电场中溶液对于固体的相对移动,琼脂是酸性物质含有较多的硫酸根,在碱性缓冲液中带负电,而与它接触的溶液带正电,因此液体向阴极移动,产生电渗),反而向阴极泳动,这样就使抗原、抗体在电场中相对移动,而形成对流。经过一定泳动时间后,在比例最适处,形成肉眼可见的白色沉淀线。由于电场作用,限制了抗原和抗体多方向的自由扩散,加速了泳动的速度,缩短了反应时间,提高了灵敏度。

(二)器材与试剂

1.器材

(1)电泳仪、电泳槽(2)载玻片(3)刻度吸量管(4)打孔器和图形卡

(5)毛细管(6)吸耳球(7)煮沸消毒水浴箱

2.试剂

(1)1.2%琼脂凝胶(2)生理盐水(3)抗原(4)抗体

(5)pH8.6 0.1M巴比妥缓冲液

(三)操作步骤:

1.取热熔的1.2%琼脂凝胶3.5ml,立即浇于载波片上,使琼脂平铺于整个玻片。待自然冷却凝固。

2.用打孔器按图形打孔,再用针尖挑去孔内琼脂。

3.将抗原和抗体用生理盐水分别稀释成1:8浓度。

4.用毛细管按顺序将抗原加入第1孔中。将抗体加入第2孔中。每孔加满为止,(注意防止溢出孔外)。

5.将琼脂凝胶玻片放人pH8.6 0.1M巴比妥缓冲液的电泳槽中,抗原端接负极,抗体端接正极,琼脂两端用四层纱布搭桥。

6.电泳,电压为110V,泳动时间30-45分钟。

7.关闭电源。

8.观察结果:从电泳槽内取出琼脂板,对光观察抗原与抗体之间有否白色沉淀线,出现沉淀线最佳比例和最高稀释度是多少,并绘出沉淀线的位置、数量、形态。

(四)注意事项

1. 浇板时,琼脂面要铺平。

2. 加样时避免样品溢出孔外。