实验七 对流免疫电泳

一、 实验目的

掌握对流免疫电泳原理及操作方法。

二、实验原理

在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓冲液中，大部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动；而大部分抗体属于IgG，在此种pH条件下只带微弱的负电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉淀线。

三、实验器材和材料

? 试剂：

人甲胎蛋白、抗人甲胎蛋白抗体、 pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液 、用巴比妥缓冲液配置1%琼脂 。

? 仪器：

电泳槽、电泳仪、水浴箱 。

? 材料：

孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、吸管、吸球等 。

四、实验方法

? 制备巴比妥琼脂凝胶：取出一清洁载玻片，用75%乙醇冲洗干净，晾干备用。将1%巴比妥琼脂融化后，置56℃水浴中备用。用吸管吸取4~4.5ml琼脂溶液滴加于玻片上，室温放置，待凝固后打孔，孔径3mm，孔距10mm。封底。

? 加样：用微量加样器分别吸取抗原10μl加入阴极侧孔内，抗体10μl加入阳极侧孔内，所加样品切勿外溢。

? 电泳：将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端，电泳槽内加pH8.6的0.05mol/L巴比妥缓冲液至电泳槽的三分之二处，琼脂板两端分别用盐桥与缓冲液相连。控制端电压为5~6V/cm板长，电泳30~60min。电泳完毕后，切断电源。

五、结果判断

在抗原和抗体两孔之间形成的白色沉淀线即为抗原抗体复合物。如果沉淀线不够清晰，于湿盒中37℃保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。

六、实验讨论

此方法简便、快捷。敏感性比双向免疫扩散法高8~16倍。

 

第二篇：免疫电泳实验

免疫电泳实验

免疫电泳是将免疫扩散和电泳相结合的一种免疫学分析技术，由Grabar与Williams于1953年创立。此项技术由于既有抗原抗体反应的高度特异性，又有电泳分离技术的快速、灵敏和高分辨力，是广泛应用于生物医学领域的一项免疫学基本技术。

【实验原理】将蛋白质抗原在琼脂糖凝胶上进行电泳，样品中不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异，而被分离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后，在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫扩散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，即可对样品中所含成分的种类及其性质进行分析、鉴定。

【主要试剂与器材】

1. 0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液。

2.12g/L琼脂凝胶  用0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液配制，置4℃冰箱保存备用。

3.小鼠全血清。

4.兔抗鼠血清。

5.电泳仪、电泳槽、37℃温箱。

6.载玻片、吸管、打孔器、毛细滴管、挖槽刀、湿盒、水平台等

【实验方法】
1．取已溶化的1%离子琼脂倾注于玻片上制成琼脂板。

孔直径3ml

2．冷却凝固后，按照模板于挖槽线上下两侧各打孔一个，并分别用微量加样器加入待检血清及1%的溴酚兰各15μl。
3．置电泳槽内，注意电泳标本近孔端连接负极“—”一侧。并将已浸透缓冲液的滤纸一端覆盖于琼脂板两侧各约0.5mm，另一端浸于电泳液中。
4．接通电源。电压、电流及时间应视仪器性能而定。100v恒压电泳。

 5．电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板。按模板位置用解剖刀挖横槽，用热的1.2%的琼脂封底，加入抗血清抗体。

6．置湿盒中，于37℃温箱中扩散24小时，观察结果。

【结果】
根据沉淀弧的位置及形状，参照免疫球蛋白迁移范围示意图，识别主要Ig。

准备实验材料：

1：小鼠全血清  （取活鼠，麻醉后心脏去血。37度放置整夜，第二天吸取上层血清。

分装，将暂时不用的放于-20度冻存，其余放置于4度）

兔抗鼠血清  -20度 冰箱中取出，实验时可能PBS 稀释部分 10倍

巴比妥缓冲液（先将0.46g 巴比妥置于三角瓶中，加入50ml蒸馏水，加热溶解后加入巴比妥钠2.575g，最后加蒸馏水至250ml）

琼脂凝胶：称取1.2g 琼脂粉至250ml三角瓶中，加巴比妥50ml，沸水浴中溶解后，再加上述巴比妥缓冲液50ml,(混匀后置于4度冰箱保存备用)