酚氯仿法和试剂盒法提取DNA实验报告
一、 实验目的
实验原理:酚氯仿法:先从全血中分离白细胞,再通过蛋白酶K
消化,通过酚、氯仿的抽提,使DNA进入水相与蛋白
质成分分开,在RNase作用下,降解RNA以纯化
DNA。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA乙二胺四乙酸二钠存在
下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体
系中晶SDS可破坏细胞膜、核膜晶并使组织蛋白
与DNA分离晶EDTA则抑制细胞中Dnase的活性
而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸
晶使DNA分子完整地分离出来。 氯仿-异戊醇溶
液可以使核蛋白变性沉淀晶将核酸物质萃取出
来再向萃取液中加入适量乙醇晶可使DNA析
出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化
研究中非常常用晶氯仿-异戊醇抽提的原理是晶
氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层
异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。而
DNA不溶于乙醇等有机溶剂晶因此可以通过乙
醇沉淀来纯化和浓缩DNA
二、 实验用品
试剂:
1mol/L(M)Tris-Cl(pH8.0), 0.5M EDTA(pH8.0),5M NaCl TES(15mM Tris, 15mM EDTA, 15mM NaCl) Tris饱和酚(PH8.0)
氯仿/异戊醇(V/V=24/1)
10%SDS
5mg/ml Protease K
70%乙醇、无水乙醇
TE缓冲液(pH8.0):10mM Tris-Cl(PH8.0)
1mM EDTA(PH8.0)
10mg/mL 溴化乙锭(EB)
耗材:
仪器:低温离心机、移液枪一套,低温冰箱,恒温水浴锅、紫外分光光度计(Eppendorf)。
三、 实验步骤
4.1取血样:实验人员相互取血样5ml.(用品:采血管、采血针、无水乙醇、棉签、橡皮管、废液缸)
4.2血液样品的预处理:分取2ml 血样加入到离心管A中用于酚氯仿法提取DNA。
1) 破除RBC:
用移液器将采血管中剩余的3ml血样中的血凝块取出转移到组织匀浆器中研磨粉碎,再移入50ml 离心管B中,再加入5倍体积无菌水,颠倒混匀,冰上静置十分钟,用于试剂盒法提取DNA。同样方法破除离心管A中的红细胞。
2)离心管A:4℃,3000rpm,离心10min,弃上清,留沉淀,重复低渗、离心处理一次。
3)离心管A:加入30ml 生理盐水,上下轻轻混匀以重新悬浮、洗涤WBC沉淀,4℃,3000rpm,离心10min,弃上清,留沉淀。转移到1.5ml离心管中。(注意尽可能将上清弃净,同时不要丢失WBC沉淀)
4)用Protease K消化WBC:
在离心管中加入4ml TES,立即用移液器吹打,将细胞团块吹散。
加入100%SDS 350 ul,5mg/ml Protease K 100ul,充分混匀,65℃消化6 h。
4.2试剂盒法提取DNA
1)向离心管B加入3倍体积的Buffer RBL 轻轻涡旋或颠倒混匀,3000rpm离心10min,小心弃上清,留沉淀。 2)向沉淀中加入400ul Buffer GR,并转移到1.5ml离心管中,混匀;在此基础上加入40ulProteaseK,混匀;再加入400ul Buffer GL ,颠倒混匀,剧烈旋涡震荡一分钟。
3)用塑料膜密封离心管管口,放入恒温箱中70℃10min,(延长孵育时间)至溶液清亮。
4)加入400ul无水乙醇,颠倒混匀,4℃,3000rpm,离心1 min。
5)将上步所得溶液加入到已装入收集管(Collection Tube)的吸附柱(Spin Column DL)中,8000g离心1min,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。
6)向吸附柱中加入500ul BufferGW1(使用前检查是否加入无水乙醇),10000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。
7)向吸附柱中加入500ul BufferGW2(使用前检查是否加入无水乙醇),10000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。
8)再次10000rpm离心2min,弃废液,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。
9)将吸附柱置于一个新的离心管中,向吸附柱的中间部位悬空加入50mlBufferGE,10000rpm离心一分钟,收集DNA溶液,-20℃保存。
4.3酚氯仿法法DNA提取
1)消化6h后的细胞悬液中加入等体积的Tris饱和酚,上下轻轻颠倒混匀,冰浴静置10min,4℃,3000rpm,离心10min。
2)将上层水相转移到一个新的离心管中,加入等体积的Tris饱和酚,上下轻轻颠倒混匀,冰浴静置10min,4℃,3000rpm,离心10min。
3)将上层水相转移到一个新的离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1),上下轻轻颠倒混匀,冰浴静置10min,4℃,3000rpm,离心10min。
4)将上层水相转移到一个小烧杯中,加入2.5倍体积的无水乙醇,冰上放置30min,可见网状DNA白色沉淀析出,轻旋小烧杯,网状DNA聚集成团。
5)用tip头将DNA捞出,放入1.5ml的Ep管中,用预冷的70%乙醇洗涤一次,4℃,10000rpm,离心10min,弃上清,放入-20℃中用吸水纸片盖住Ep管口,过夜干燥。 6)加入50ulTE溶液!!!!
第一天匀浆机粉碎组织,加入1.5mlEP管,管中加入0.5毫升DNA Extraction Buffer 和100uL蛋白酶K,转动倒置管子混匀,55度过夜孵化。第一个小时内多次摇动管子充分混匀蛋白酶和样本第二天 3 MaXtract gel tubes 15000rpm 离心for 3minutes,把凝胶甩到基底,(大于2ml再分装一管)4 转移消化好的溶液至标记好的 MaXtract gel tubes5 向每个 gel tubes加入等体积Phenol/Chloroform (pH 8.0).6 gel tubes 15000rpm for 5minutes,凝胶基质以上为水层,,凝胶基质以下为有机层7 取水层至新的且作好标记的EP管8 。每个Eppendorf管中加入无水乙醇650uμ,200μL7.5 Mol/L醋酸铵(NH4Ac),和1-2μLGlycoBlue9 -20度下冷冻过夜沉淀,最佳时间为3天第三天10 15000 rpm for 45minutes11 弃上清,确保不打跑沉淀。12 1毫升70%的乙醇清洗并且15000rpm for 15minutes13 弃上清,小心不要丢失沉淀物,放在化学通风橱风干酒精,如果仍可见酒精,可以尝试用20毫升pipette tip 取出,以减少风干时间14 加入50ul TE buffer 处理过的水
1实验目的1通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒2通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术2实验材料及用品1实验仪器…
质粒DNA抽提实验报告一实验目的1掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增等2学习利用水平…
实验一质粒DNA的提取及检测实验目的1掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3学会PCR操作的…
生物学大实验二实验名称质粒扩增提取和鉴定实验实验目的通过对智力扩增提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作加深对分子生物学基本技术的…
质粒DNA的提取一实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异三实验步骤1质粒提取1100…
大肠杆菌和植物基因组DNA提取生科基彭健鹏20xx1412420xx1大肠杆菌DNA提取方案设计实验目的学习并掌握细菌基因组的提取…
基因组DNA的提取和电泳实验五实验报告一实验目的了解DNA提取的方法以及琼脂糖凝胶电泳分析DNA技术二器材和试剂1器材水平琼脂糖电…
一实验名称质粒DNA的提取与纯化DNA琼脂糖凝胶电泳二实验原理1质粒DNA的提取质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外细…
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428环境科学一实验目的1学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术2对扩增后的DNA进…