酚氯仿法提取DNA实验报告

酚氯仿法和试剂盒法提取DNA实验报告

一、 实验目的

实验原理:酚氯仿法:先从全血中分离白细胞,再通过蛋白酶K

消化,通过酚、氯仿的抽提,使DNA进入水相与蛋白

质成分分开,在RNase作用下,降解RNA以纯化

DNA。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA乙二胺四乙酸二钠存在

下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体

系中晶SDS可破坏细胞膜、核膜晶并使组织蛋白

与DNA分离晶EDTA则抑制细胞中Dnase的活性

而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸

晶使DNA分子完整地分离出来。 氯仿-异戊醇溶

液可以使核蛋白变性沉淀晶将核酸物质萃取出

来再向萃取液中加入适量乙醇晶可使DNA析

出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化

研究中非常常用晶氯仿-异戊醇抽提的原理是晶

氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层

异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。而

DNA不溶于乙醇等有机溶剂晶因此可以通过乙

醇沉淀来纯化和浓缩DNA

二、 实验用品

试剂:

1mol/L(M)Tris-Cl(pH8.0), 0.5M EDTA(pH8.0),5M NaCl TES(15mM Tris, 15mM EDTA, 15mM NaCl) Tris饱和酚(PH8.0)

氯仿/异戊醇(V/V=24/1)

10%SDS

5mg/ml Protease K

70%乙醇、无水乙醇

TE缓冲液(pH8.0):10mM Tris-Cl(PH8.0)

1mM EDTA(PH8.0)

10mg/mL 溴化乙锭(EB)

耗材:

仪器:低温离心机、移液枪一套,低温冰箱,恒温水浴锅、紫外分光光度计(Eppendorf)。

三、 实验步骤

4.1取血样:实验人员相互取血样5ml.(用品:采血管、采血针、无水乙醇、棉签、橡皮管、废液缸)

4.2血液样品的预处理:分取2ml 血样加入到离心管A中用于酚氯仿法提取DNA。

1) 破除RBC:

用移液器将采血管中剩余的3ml血样中的血凝块取出转移到组织匀浆器中研磨粉碎,再移入50ml 离心管B中,再加入5倍体积无菌水,颠倒混匀,冰上静置十分钟,用于试剂盒法提取DNA。同样方法破除离心管A中的红细胞。

2)离心管A:4℃,3000rpm,离心10min,弃上清,留沉淀,重复低渗、离心处理一次。

3)离心管A:加入30ml 生理盐水,上下轻轻混匀以重新悬浮、洗涤WBC沉淀,4℃,3000rpm,离心10min,弃上清,留沉淀。转移到1.5ml离心管中。(注意尽可能将上清弃净,同时不要丢失WBC沉淀)

4)用Protease K消化WBC:

在离心管中加入4ml TES,立即用移液器吹打,将细胞团块吹散。

加入100%SDS 350 ul,5mg/ml Protease K 100ul,充分混匀,65℃消化6 h。

4.2试剂盒法提取DNA

1)向离心管B加入3倍体积的Buffer RBL 轻轻涡旋或颠倒混匀,3000rpm离心10min,小心弃上清,留沉淀。 2)向沉淀中加入400ul Buffer GR,并转移到1.5ml离心管中,混匀;在此基础上加入40ulProteaseK,混匀;再加入400ul Buffer GL ,颠倒混匀,剧烈旋涡震荡一分钟。

3)用塑料膜密封离心管管口,放入恒温箱中70℃10min,(延长孵育时间)至溶液清亮。

4)加入400ul无水乙醇,颠倒混匀,4℃,3000rpm,离心1 min。

5)将上步所得溶液加入到已装入收集管(Collection Tube)的吸附柱(Spin Column DL)中,8000g离心1min,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。

6)向吸附柱中加入500ul BufferGW1(使用前检查是否加入无水乙醇),10000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。

7)向吸附柱中加入500ul BufferGW2(使用前检查是否加入无水乙醇),10000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。

8)再次10000rpm离心2min,弃废液,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。

9)将吸附柱置于一个新的离心管中,向吸附柱的中间部位悬空加入50mlBufferGE,10000rpm离心一分钟,收集DNA溶液,-20℃保存。

4.3酚氯仿法法DNA提取

1)消化6h后的细胞悬液中加入等体积的Tris饱和酚,上下轻轻颠倒混匀,冰浴静置10min,4℃,3000rpm,离心10min。

2)将上层水相转移到一个新的离心管中,加入等体积的Tris饱和酚,上下轻轻颠倒混匀,冰浴静置10min,4℃,3000rpm,离心10min。

3)将上层水相转移到一个新的离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1),上下轻轻颠倒混匀,冰浴静置10min,4℃,3000rpm,离心10min。

4)将上层水相转移到一个小烧杯中,加入2.5倍体积的无水乙醇,冰上放置30min,可见网状DNA白色沉淀析出,轻旋小烧杯,网状DNA聚集成团。

5)用tip头将DNA捞出,放入1.5ml的Ep管中,用预冷的70%乙醇洗涤一次,4℃,10000rpm,离心10min,弃上清,放入-20℃中用吸水纸片盖住Ep管口,过夜干燥。 6)加入50ulTE溶液!!!!

 

第二篇:酚氯仿提取DNA方法

第一天匀浆机粉碎组织,加入1.5mlEP管,管中加入0.5毫升DNA Extraction Buffer 和100uL蛋白酶K,转动倒置管子混匀,55度过夜孵化。第一个小时内多次摇动管子充分混匀蛋白酶和样本第二天 3 MaXtract gel tubes 15000rpm 离心for 3minutes,把凝胶甩到基底,(大于2ml再分装一管)4 转移消化好的溶液至标记好的 MaXtract gel tubes5 向每个 gel tubes加入等体积Phenol/Chloroform (pH 8.0).6 gel tubes 15000rpm for 5minutes,凝胶基质以上为水层,,凝胶基质以下为有机层7 取水层至新的且作好标记的EP管8 。每个Eppendorf管中加入无水乙醇650uμ,200μL7.5 Mol/L醋酸铵(NH4Ac),和1-2μLGlycoBlue9 -20度下冷冻过夜沉淀,最佳时间为3天第三天10 15000 rpm for 45minutes11 弃上清,确保不打跑沉淀。12 1毫升70%的乙醇清洗并且15000rpm for 15minutes13 弃上清,小心不要丢失沉淀物,放在化学通风橱风干酒精,如果仍可见酒精,可以尝试用20毫升pipette tip 取出,以减少风干时间14 加入50ul TE buffer 处理过的水

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