实验七、琼脂扩散试验

一、实验目的

掌握双向琼脂扩散试验的原理、操作方法及结果判定方法。

二、实验原理

可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。

三、材料与试剂

传染性法氏囊病毒标准抗原、传染性法氏囊病毒标准阳性抗体，待测鸡血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。

四、操作步骤

1、将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装入三角烧瓶，煮沸，然后用吸管吸取7ml加入平皿内（勿有气泡）使成约3mm厚的凝胶，待冷却凝固后按如下图方式打孔。（注意打孔完毕要封底）

2、加样。中间孔加标准抗原，外周孔加被检血清及阳性血清（如要测被检血清的效价，外周孔可倍比稀释后依次加入）。

3、将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

结果判断：阳性：标准对照孔之间有明显的沉淀线时，受检孔与中央孔之间形成沉淀线并与阳性对照沉淀线融合。阴性：受检孔与中央孔之间无沉淀线。

五、注意事项

1、每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加满，又必须不使样品溢出孔外。

2、打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。

六、实验报告

1、说明环状沉淀试验检测结果；

2、画出双向琼脂扩散试验中你所观察到的沉淀线，并对其进行简要说明。

3、思考题

（1）影响琼脂扩散试验结果的因素有哪些？

（2）若试验结果观察不到沉淀线，可能原因有哪些？

 

第二篇：试验 双向免疫扩散 (1)

实验 双向免疫扩散法

【原理】

可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的若干性质，如浓度、特异性等。

【实验材料】

0.8%琼脂糖(巴比妥缓冲液配制)

巴比妥钠缓冲液(μ=0.05，pH=8.6)：巴比妥钠10.30g、巴比妥1.84g、甘氨酸1.0g、Peg6000 4g，加900ml水加温助溶，待冷，转入1000ml容量瓶内，再加水到刻度，测试pH后装瓶待用。

载玻片

打孔器

微量加样器及塑料吸头

湿盒

抗原：人IgG蛋白

抗体：兔抗人IgG免疫血清

【实验方法】

1）将已溶化的0.8%琼脂糖管放90~95℃水浴箱中平衡温度备用；

2）将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂约4mL，使成厚度约1.5~2mm琼脂板；（注意：倾注速度不要过快，以免琼脂溢出载玻片；倾注过程要连续以保证琼脂板均匀平滑）；

3）琼脂凝固后，用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型，本次试验采用梅花型。梅花型即七个孔构成一组，孔径3mm，孔距4mm；梅花型打孔可以依据模板。为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶的边缘打孔或切角标记。打孔完毕后，将载玻片在酒精灯的火焰上过几遍，可防止漏液。

4）免疫血清的稀释：取5只干净的小试管，各加入70μL的生理盐水。取70μL免疫血清加入第一支试管，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:2稀释血清；再从第一支试管中吸取70μL的1:2稀释血清加入第二只试管中，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:4稀释血清；依次操作，即可得到1:8、1:16、1:32的倍比稀释血清。

4）用微量加样器加6~8?L抗原于中央孔中，周围各孔分别各加6~8?L不同稀释度的免疫血清；注意每加一样品均需更换吸头，以防止交叉污染，影响实验结果；加样时，不要使样品溢出加样孔。

5）作好标记，放湿盒中，湿盒中垫上干净的纱布，用蒸馏水润湿，置37℃温箱，24h后观察结果。

【实验结果判断】

判断家兔体内所产生的抗体效价，以确定后续试验条件。