沉淀实验——双向琼脂扩散实验

内容提要：利用双向琼脂扩散试验测定不同浓度的鸡传染性法氏囊病病毒抗原药物扩散速率，观察实验结果并且总结

关键词：双向琼脂扩散试验  琼脂凝胶配制  制板  打孔  封底  加样  稀释抗原  响因素

引言：

目的：掌握双向琼脂扩散试验的基本操作和临床应用。

实验原理：琼脂的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移，合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀，沉淀的产生组织抗原抗体复合物的自由运动，沉淀带行程一种特异性的半渗透性屏障，阻滞相同抗原抗体复合物，而允许不同的分子通过。

实验仪器和药品：Nacl、蒸馏水、琼脂粉、电炉、平皿、硫柳汞、打孔器、电子秤、酒精灯、微量移液器、微量反应板、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验阳性血清（兽药生字（2007）150138086青岛易邦生物工程有限公司）、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原（兽药生字（2007）150138086青岛易邦生物工程有限公司）。

实验内容及步骤：

1.       琼脂凝胶的配制：取8g Nacl溶解于100ml蒸馏水中，加优质琼脂粉1g，电炉缓慢加热使之彻底融化。

2.       制板：将清洁的平皿置于水平桌面上，每个平皿分别倒入加热融化的1%琼脂约10ml，使其厚度大约为3mm，注意切勿产生气泡。置于4℃保存（需保存较长时间时加入1%硫柳汞1ml）

3.       打孔：冷凝后打孔，打孔器内径约3mm。按图1在固定的位置用打孔器垂直打孔，用7号针头挑去孔中琼脂。

4．封底：将琼脂平板置于酒精灯上微微加热，使孔底琼脂微融而封住孔底。

5．加样：用微量移液器在中央孔加入已知的诊断抗原，外周孔加入待检血清，图2。置于37℃培养箱中反应24h，观察实验。注：（加样至孔满为止，不可外溢。待孔内液体渗入凝胶后即可放入温盒中。温盒约37℃，一般保存24-48h，观察抗原抗体产生的沉淀线）

稀释抗原：将①里接入80ul抗原，将②--⑤接入40ul生理盐水，用移液枪吸取40ul①溶液，移入②中，混匀，然后从②吸取40ul溶液移入③中，混匀，然后从③吸取40ul溶液移入④中，混匀，然后从④吸取40ul溶液移入⑤中，混匀，⑥放入生理盐水40ul。 

实验结果与分析：

观察孔间沉淀线的数目与特征，一般可注意到以下几种现象：

1、抗原与抗体孔间形成一条沉淀线，说明只有一种抗原与相对应的抗体特异性结合，如出现数条沉淀线，说明有几组不同的抗原和相对应抗体相结合

2、根据抗原的成份可有以下三种现象：1）若二孔中的抗原相同，与相应抗体形成的沉淀线融合成弧形；（2）若二孔中抗原不同，当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时，则形成的沉淀线相交叉；（3）若两孔中抗原部分相同，抗血清中有各相应的抗体，形成的沉淀线相切。

　　3、相应抗原抗体所形成的沉淀线，如二者浓度相当，沉淀线在孔中央，二者浓度不当时，则沉淀线偏向浓度低的一侧[1]

                            

    图3和图4中①是鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验阳性血清。②是鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原原液。③是1/2鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原④1/4鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原⑤1/8鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原⑥1/16鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原⑦生理盐水

  

琼脂扩散结果受许多因素影响。

1.       温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反映在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱4℃中为佳。

2.       琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。

3.       参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成越慢，所以孔距以0.25-0.5cm为好，距离远影响反映速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线输的的测定。

4.       时间对沉淀线的影响：沉淀线的形成一般在27小时观察出现，放过久可能出现沉淀线重合，沉淀线消失。

5.       人为的一些操作失误，操作误差等

第一组人员试验由于多方面因素导致出现类似图3的结果。[2]

总结：

    第一小组成员工作不够细心，导致出现多种失败案例，感到欣慰的是有一份置于常温下的平皿取得唯一的成功。

双向琼脂扩散试验常用于定性检测，也可用于半定量检测。将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶板上相邻近的小孔内，让它们相互向对方扩散。当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。这种试验方法有很多临床应用。根据有否出现沉淀线，可用已知的抗体鉴定未知的抗原，或用已知的抗原鉴定未知的抗体。临床常用本方法检查原发性肝癌患者血清中的甲胎蛋白，作为原发性肝癌的早期辅助诊断。

[1]摘自百度

[2]摘自百度

注：以上图片由某人提供

 

第二篇：试验 双向免疫扩散 (1)

实验 双向免疫扩散法

【原理】

可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的若干性质，如浓度、特异性等。

【实验材料】

0.8%琼脂糖(巴比妥缓冲液配制)

巴比妥钠缓冲液(μ=0.05，pH=8.6)：巴比妥钠10.30g、巴比妥1.84g、甘氨酸1.0g、Peg6000 4g，加900ml水加温助溶，待冷，转入1000ml容量瓶内，再加水到刻度，测试pH后装瓶待用。

载玻片

打孔器

微量加样器及塑料吸头

湿盒

抗原：人IgG蛋白

抗体：兔抗人IgG免疫血清

【实验方法】

1）将已溶化的0.8%琼脂糖管放90~95℃水浴箱中平衡温度备用；

2）将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂约4mL，使成厚度约1.5~2mm琼脂板；（注意：倾注速度不要过快，以免琼脂溢出载玻片；倾注过程要连续以保证琼脂板均匀平滑）；

3）琼脂凝固后，用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型，本次试验采用梅花型。梅花型即七个孔构成一组，孔径3mm，孔距4mm；梅花型打孔可以依据模板。为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶的边缘打孔或切角标记。打孔完毕后，将载玻片在酒精灯的火焰上过几遍，可防止漏液。

4）免疫血清的稀释：取5只干净的小试管，各加入70μL的生理盐水。取70μL免疫血清加入第一支试管，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:2稀释血清；再从第一支试管中吸取70μL的1:2稀释血清加入第二只试管中，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:4稀释血清；依次操作，即可得到1:8、1:16、1:32的倍比稀释血清。

4）用微量加样器加6~8?L抗原于中央孔中，周围各孔分别各加6~8?L不同稀释度的免疫血清；注意每加一样品均需更换吸头，以防止交叉污染，影响实验结果；加样时，不要使样品溢出加样孔。

5）作好标记，放湿盒中，湿盒中垫上干净的纱布，用蒸馏水润湿，置37℃温箱，24h后观察结果。

【实验结果判断】

判断家兔体内所产生的抗体效价，以确定后续试验条件。