实验一 双向免疫扩散试验

一、实验目的

1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤

2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术

二、实验原理

在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。

利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20 万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。

双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。

三、实验仪器和试剂

1、仪器设备

载玻片、打孔器和挑针、湿盒、恒温箱、三角瓶、移液管、微量移液器

2、试剂和材料

（1）生理盐水

（2）1.2%琼脂胶：称取1.2 g 琼脂糖，加100mL 生理盐水，加热溶解

（3）抗原及相应免疫血清：抗原为人IgG，抗体为羊抗人IgG 免疫血清

四、实验步骤

1、制备琼脂玻片：将已加热溶化的1.2%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室温自然冷却凝固。

2、打孔：在凝固的琼脂糖胶上用打孔器或吸嘴按图1 打梅花孔（孔径约3mm，孔距4mm），用针头小心挑去琼脂。为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶边缘打上小孔或切角标记。打孔完毕，将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液。       

3、稀释免疫血清：取5 支0.5mL 的离心管，各加入10μL 生理盐水。如图2 所示，取10μL 免疫血清加入1 号管中，吸打使其与生理盐水混匀，即为1︰2 稀释血清；再从1 号管吸取1︰2 稀释血清10μL 加入2 号管中，吸打混匀，即为1︰4 稀释血清；重复操作，获得1︰8、1︰16 和1︰32倍比稀释血清。

图2 倍比稀释免疫血清

4、加样：以上方孔为第1 孔，按顺时针方向分别称为2、3、4、5 和6 孔。抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1 孔加生理盐水，以作空白对照，每孔加样10μL。

5、温育：将琼脂糖胶置于湿盒（饭盒垫上纱布，加蒸馏水润湿）中，37℃温育12-24 h。

6、结果观察：观察抗原抗体产生的白色沉淀线。免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。

五、注意事项

1、制备琼脂玻片时，用移液管向玻片加上琼脂时，要一次性迅速完成，防止形成气泡或在移液管中凝固，影响操作或结果。

2、打孔时，其他六个孔要尽量围着中间孔呈圆形均匀分布。

2、注意记录琼脂糖胶的标记和加样顺序。

六、结果分析

试验结果如右图所示:从图中我们可以看到一条白色沉淀线，说明以人IgG与羊抗人IgG 免疫血清相关，在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物。而这条线沿着各孔边缘弯曲，且随着血清浓度从第一孔到第五孔递减，第六孔为生理盐水，其颜色从第一孔到第五孔逐渐变浅，到第六孔消失。这符合试验原理，证明试验操作成功。

七、问题讨论

1、为什么将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液？

答：因为加温可以使琼脂溶解，封闭住打孔可能产生的细小裂痕，以免试剂随裂痕漏出影响实验结果判定

 

第二篇：免疫双向扩散实验

双向扩散法—抗原分析

【原理】

双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。

【材料】

生理盐水1%琼脂管（每管约4ml）

载玻片

打孔器及打孔模板

微量加样器及塑料吸头

抗体及抗原1、2、3、4、5、6。

湿盒

【方法】

1．将已溶化的1%琼脂盐水管放56~60℃水浴箱中平衡温度备用。

2．将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂3.5~4ml，使成厚度约1.5mm琼脂板。

3．凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次实验采用三角型，即每一个三角型的三个孔为一组。（因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成两组。否则，如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出，如制成三角型三组，因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果）。

4．用微量加样器加抗体各10μl。各组所余两孔各按抗原1、2为一组，3、4为二组，5、6为三组，分别各加入10μl。注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头，以防止交叉现象影响实验结果。

5．作好记录，放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。

【结果】

说明：

（1）融合性沉淀弧，说明两孔中抗原相同，为同一性反应。

（2）两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应。

（3）融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分，此为部分同一性反应。

单向免疫扩散法（Single radil immunodiffusion）—正常人群IgG正常值检测

【原理】

在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，既形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/ml或IU/ml）。

应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的含量及正常值。

【材料】

1．示教部分：

2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2‰NaN3）

标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）

参考蛋白工作标准（北京生物制品研究所生产）

pH7.2 PBS

玻璃板或载玻片。

打孔器（孔径3mm）及打孔模板。

微量加样器

湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）

2．实验部分：

已制备好的含有马抗人IgG抗体的1%琼脂板。

1:50稀释的单人份待检血清标本。

打孔器、模板、微量加样器及湿盒等。

【方法】

（一）标准曲线的制备：示教

1．按照玻片的大小，以能制做1~1.5mm厚度的琼脂板的量，分装其1/2量的2%盐水琼脂。例如，用普通载玻片制做时其1%琼脂量为4ml，在分装2%盐水琼脂时既为2ml。溶化后置56~60℃水浴中平衡温度备用。

2．稀释抗体：将标准抗人IgG抗体按其效价用pH7.2 PBS做成1倍稀释。例如，血清效价为1:140，原浓血清既应稀释为1:70。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。

3．制板：将已稀释的抗人IgG抗体于56℃水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56~60℃的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1~2次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），迅速倾注于玻片上，待凝固后既制成。

4．打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。

5．稀释不同浓度的参考蛋白标准（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG为100单位/ml，80.4微克/单位，其稀释范围为1:10、1:20、1:40、1:80及1:160。

6．加样：将已稀释的不同浓度的工作标准顺序用微量加样器每孔加入10μl（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。

7．置湿盒中，放37℃温箱，24小时后观察结果。

8．用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，不同单位/ml为横座标，绘制成标准曲线。

在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。

（二）正常人血清中IgG值的测定：

1．将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4个（孔径3mm，孔距10mm）。

2．将单份正常人血清用pH7.2 PBS分别作1:50稀释。

3．用微量加样器分别取1:50稀释的单人份血清标本10μl加入孔中，每份标本应各加两孔（每份标本均应更换塑料吸头）。

4．作好标记置湿盒中，放37℃温箱，24小时后观察结果。

【结果】

测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的单位/ml，并换算为mg/ml。

将全班实验结果做出统计及均值，并写出较完整的实验报告。