免疫学实验

实验一、免疫细胞的形态观察

一、实验目的

1、掌握微量采血及血涂片的制作方法。

2、在光学显微镜下观察免疫细胞。

二、实验原理

血涂片是临床化验中最常规的技术,也是血液学研究中的最基本技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本,经瑞氏(Wright)染液染色后,不同免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。根据细胞中颗粒的颜色大小及多少,再结合细胞的大小及细胞核的形态,就可以将免疫细胞进行分类计数。

三、实验器材

1、器材:医用一次性采血针、酒精棉球、经脱脂洗净的载玻片。

2、试剂:瑞氏(Wright)染液,瑞特氏染料0.1克溶于60mL甲醇中,过滤。贮藏褐色瓶中备用。(配制时,要先将瑞特氏染料置研钵内边研磨边滴加甲醇,使染料溶解的更好。)

四、实验步骤

1、采血

采血前用75%酒精棉球消毒人的指腹或耳垂,干后用采血针刺破指腹或耳垂的皮肤;动物采血时先将耳部剪毛,酒精消毒后刺破动物耳部皮肤,挤去第一滴血不要(因含单核细胞较多)。

2、涂片

挤出第二滴血置于载玻片的一端,再取另一张边缘光滑的载玻片,斜置于血涂片的前缘,先向后稍移动轻轻触及血滴,使血液沿玻片端展开成线状,两玻片的角度以30~40度为宜(角度过大血膜较厚,角度小则血膜薄),轻轻将载玻片向前推进,即涂成血液薄膜(如图),推进时速度要一致,否则血膜成波浪形,厚薄不匀。

3、染色

    待涂片在空气中完全干燥后,滴加数滴瑞氏染液盖满血膜为止,染色1~3min。然后滴加等量的缓冲液(pH6.4)或蒸馏水冲去染液,吸水纸吸干,镜检。

4、封片

    经染色的涂片完全干燥后,用中性树胶保存。

5、观察

分别用低倍、高倍和油镜观察血涂片,分辨不同的血细胞类型。

五、实验结果

拍摄血细胞照片,标出并分析比较各种免疫细胞类型和形态特征。


实验二、中性粒细胞吞噬功能试验(小吞噬试验)

一、实验目的

1、熟悉中性粒细胞的吞噬作用的原理和方法。

2、通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。

二、实验原理

血液中的中性粒细胞即小吞噬细胞,通过趋化、调理、吞入和杀菌等几个步骤,能吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物,是机体非特异性免疫的重要组成部分。

在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒在一定条件下共同孵育后,显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物颗粒。计数吞噬有细菌或异物颗粒的中性粒细胞占中性粒细胞总数的百分率和每个中性粒细胞平均吞噬的细菌或异物颗粒,可反映中性粒细胞的吞噬功能。有助于对疑有吞噬细胞功能障碍的疾病作出诊断。该试验常用白色葡萄球菌作为中性粒细胞的吞噬物。

三、实验材料

1、待测样本:新鲜抗凝静脉血。(肝素溶液浓度为25U/ml,以生理下水配制)

2、被吞噬物:白色葡萄球菌。

3、试剂:肉汤培养基,琼脂,无菌生理盐水,甲醇,瑞氏-吉姆萨染液。

瑞氏-姬姆萨染色液配制:

 原料:A:瑞氏染粉0.8--1克;吉姆萨染粉0.5克;B:甘油33ml;C:甲醇500ml。

配法:将A放入研钵中,加入少量B研磨,再加入少量B磨,再加入少量B磨……倒出,将未溶部分,继续加入B磨……>全溶,加入C,或中间加入C亦可。

4、器材:血红蛋白吸管,采血针,试管,EP管,平皿,75%酒精棉球、载玻片,微量移液器、恒温箱,显微镜(香柏油,二甲苯)等。

四、实验方法

1、白色葡萄球菌液的制备

用无菌生理盐水洗下白色葡萄球菌接种于普通斜面18~24h 培养物,置100℃水浴15min杀死细菌,经菌液计算后用生理盐水调整至6×108/ml,置4℃备用。

2、待测样本制备

于洁净的0.5mlEP管内加20μl肝素溶液,用75%酒精棉球对受试者耳垂或指腹消毒,干燥后用采血针针刺,轻轻揉挤出血,用血红蛋白吸管吸取40μl,与EP管内的肝素溶液轻轻吹吸混匀。

3、孵育

待测样本中加入白色葡萄球菌液20μl轻轻吹吸混匀,放入恒温箱37℃孵育30min,期间每隔10min摇匀一次。

4、制片

取一小滴孵育后的待测样本于洁净载玻片上,用另一载玻片推成薄血膜,晾干后甲醇固定4~5min。

5、瑞氏-吉姆萨染色:滴加瑞氏-吉姆萨染液染色1~2min,水洗,晾干。

6、镜检

置油镜下观察计数,计算吞噬率和吞噬指数。

五、实验结果

计数200个中性粒细胞,分别记录吞噬细菌的细胞数和每个中性粒细胞吞入的细胞数,按下式计算吞噬率和吞噬指数。

   吞噬率=(200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数/200)×100%

   吞噬指数=(200个中性粒细胞中吞噬细菌的总数/200)×100% 

【注意事项】

 1、所用器材要清洁。

 2、如细菌数太多可增加稀释倍数作平皿培养后计数。

 3、血膜必须充分干燥,否则在染色过程中易脱落。

 4、染液不可过少,以防止蒸发干燥,沉着于血片上不易冲掉。

 5、冲洗时应以流水将染液冲去,不可先倒掉染液,以免染料沉着于血膜上。

 6、越接近推片末梢,细胞数越多。计数时应取玻片前、中、后三段计数,以提高准确率。

【思考题】

 1、简述中性粒细胞吞噬功能测定的原理。

 2、该实验过程中应注意哪些事项?

附:小鼠中性粒细胞吞噬功能试验

一、实验目的:同前。

二、实验原理:同前。

三、实验材料

1、金黄色葡萄球菌悬液。

2、瑞氏染液、双蒸水。

3、试管、玻片、采血针、酒精棉球、吸管、滴管、显微镜、香柏油。

四、实验方法

1、取小鼠一只,给腹腔注射金黄色葡萄球菌悬液0.6ml,10~15min。

2、取小鼠腹腔液。

3、置37℃水浴箱水浴15分钟,中途混匀一次。

4、取出小试管,用吸管将试管中血液打匀后取血半滴于载玻片上,用另一载玻片推成薄血片。

5、待血片自干后,用瑞氏染液染色。

瑞氏染色法:取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分钟。然后加等量蒸馏水,轻轻晃动混匀,继续染5分钟,水洗,用吸水纸吸干后镜检。

五、结果观察

油镜检查:寻找中性粒细胞,如果染色结果正确,可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色,而粒细胞的细胞浆则为淡红色。

中性粒细胞吞噬试验计数:

1、吞噬百分率:观察100个中性粒细胞,计算其中吞噬有细菌的中性粒细胞数,计算出吞噬细胞百分率。

2、吞噬指数:观察100个中性粒细胞,计算其中被吞噬的细菌总数,平均每个中性粒细胞吞噬的细菌数即为吞噬指数。


实验五、双向琼脂扩散试验

双向琼脂扩散试验常用于定性检测,也可用于半定量检测。将抗原 与抗体分别加入琼脂凝胶板上相 邻近的小孔内,让它们相互向对方扩散。当两者在最适当比例处相遇时,即形成一条清晰的沉淀线。根据有否出现沉淀线,可用已知的抗体鉴定未知的抗原,或用已知的抗原鉴定未知的抗体。临床常用本方法检查原发性肝癌患者血清中的甲胎蛋白,作为原发性肝癌的早期辅助诊断。

    甲种胎儿蛋白(α-Fetal protein, AFP),是胎儿组织及体液中的正常组织成份。胎儿在第9周才出现此种蛋白,13~19周达高峰,到21周后逐渐下降,胎儿出生后该蛋白即行消失或含量甚微,普通试验方法检查不出,而肝癌病人及个别卵巢癌或睾丸癌病人的血清检出有此种蛋白。

一、实验目的

1、熟悉双向琼脂扩散试验的原理。

2、掌握双向琼脂扩散试验的操作方法。

二、实验原理

    可溶性抗原(如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等)与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散,二者相遇,在比例合适处形成白色沉淀。  

    抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中,两者各自向四周扩散,如两者相对应,浓度比例合适,则经一定时间后,在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线,若同时含有若干对抗原抗体系统,因其扩散速度的不同,可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况,还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以,可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份,并用以测定抗原或抗体的效价。

三、实验材料

羊抗人全血清,小牛血清,正常人混合血清,精制琼脂粉,生理盐水、载玻片,打孔器(直径3mm)、湿盒、吸管等。

四、实验方法

1、用生理盐水配制1.0~1.5%琼脂,隔水煮沸使溶化,用吸管吸取4ml趁热浇于载玻片上,制成琼脂板。

2、待琼脂凝固后,用打孔器打3个距离相近的孔,并用针头挑去孔中琼脂(孔距为5mm)。

3、在①孔中加正常人混合血清,在②孔中加小牛血清,③孔中加羊抗人全血清,注意不要溢出。

4、将加好样品的琼脂板置于湿盒内,于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

五、实验结果

观察孔间沉淀线的数目与特征,一般可注意到以下几种现象:

1、抗原与抗体孔间形成一条沉淀线,说明只有一种抗原与相对应的抗体特异性结合,如出现数条沉淀线,说明有几组不同的抗原和相对应抗体相结合

2、根据抗原的成份可有以下三种现象:(1)若二孔中的抗原相同,与相应抗体形成的沉淀线融合成弧形;(2)若二孔中抗原不同,当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时,则形成的沉淀线相交叉;(3)若两孔中抗原部分相同,抗血清中有各相应的抗体,形成的沉淀线相切。

3、相应抗原抗体所形成的沉淀线,如二者浓度相当,沉淀线在孔中央,二者浓度不当时,则沉淀线偏向浓度低的一侧

 

第二篇:免疫学实验指导书

 

免疫学实验指导

     

刘佳斌编

    

生命科学学院

生物技术系

2005.3

实验1

动物的注射采血及血清制备

    家兔采血有耳静脉采血,耳动脉放血,心脏采血和劲动脉放血法,耳缘静脉采血一般适用于只需少量血液,常用于免疫注射采少量血,测其效价,心脏采血和耳动脉采血法,耳缘静脉采血一般只适用少量采血。常用于免疫注射采少量血,测其效价。心脏采血和耳缘动脉采血可采大量血有能保存动物,从动脉可采大量,动物死去。兔一般采血20ML不影响其存活。

鸡一般用心脏采血法,每只鸡一次取血20ML,不影响其存活,经3—6个月后,可再次采血。注射途径一般有皮下、静脉、皮内和腹腔。

一、目的与内容:

(一)目的

1.学习动物不同部位的采血方法

    2.练习对家兔耳静脉的注射方法

3.用离心法制备血清

(二)内容

1、鸡心脏采血

2、家兔采血

3、制备血清

二、材料与用品

(一)材料

兔、鸡  

(二)用品

生理盐水、注射器、剪刀、镊子、试管、离心管、离心机

三、操作与观察

 (一)鸡心脏采血

     1、固定鸡腿、翅膀,拔取心脏部位羽毛,用手将鸡按定。

     2、寻找内肋骨到肩胛部皮下静脉,心脏在此静脉分支下面,以食指触摸心跳,消毒,垂直刺入针头,如触及肋骨则稍后退,将针头稍后偏于胸骨,切不可硬往里插,针头向里刺入后,可感到心脏跳动。此时,针头刺入心脏,徐徐抽取血液。采血20ML取下针头,将血液放入离心管。

(二)家兔采血

1、家兔心脏采血

(1)固定兔,剪取左前胸心脏部位的毛,酒精棉球消毒皮肤。

(2)用左手食指、中指、无名指防在右胸处,轻轻向左推,将心脏推至左恻固定,拇指在胸左恻由下向上数至第三至四肋骨探测心脏搏动最剧烈处

(3)将针头从搏动处刺入心脏,若准确徐徐抽取血液,足量后拔除,再改变方向成径直刺入心脏,取血液20ML,放入离心管。

(4)家兔静脉注射,在耳缘静脉注入1ML生理盐水。

2、家兔耳缘静脉采血。

(三)制备血清

四、作业与思考

1、心脏采血关键什么?需要注意哪些问题?

2、抓兔子时为什么不能抓它的双耳?正确的抓取方法是什么?


实验2

抗原与免疫血清的制备

将抗原注射入动物体内,刺激动物的B淋巴细胞转化为浆细胞,产生特异性抗体。待其血清中累积大量抗体时,采其血液分离血清,即抗体的免疫血清。抗原量低到一定程度时,抗体不能产生或用现有方法不能测出,但超过最高限度,又对抗体产生抑制作用。本实验抗原为细菌细胞,采用每毫升含9亿个细菌比较恰当。

一、目的与内容

(一)目的

1、抗原与抗体的制备方法

2、为凝集实验制备材料

(二)内容

1、抗原的制备

2、免疫血清的制备

二、材料与用品

(一)材料

大肠杆菌,家兔

(二)用品

麦氏比浊管,试管,注射器,9号、7号针头,离心机等

0.5%的石炭酸生理盐水

三、操作与观察

(一)抗原的制备

(1)       取5ML0.5%的石炭酸生理盐水,注射大肠杆菌斜面,洗下菌台

(2)       用无菌毛细菌滴管吸取洗下的菌液,注入无菌小试管

(3)       将此含有菌液的小试管放60度水浴箱中1小时,并不时摇动。

(4)       取一与比浊管同质量的小试管,加菌液1ml,再加石炭酸生理盐水4ml(或更多,是原菌液浓度而定),混匀后各比浊管比浊。

麦氏比浊法原理:某一未知菌浓度,菌液在投射光作用下用肉眼与某一比浊管比较,如果二者透光度相同,即可目测该菌大致浓度。

(5)稀释:用0.5%的生理盐水,待菌液稀释9亿/ml,即等浊于第3支。

(二)免疫血清的制备

(1)注射动物:耳缘静脉注射抗原。

(2)14日采血1ml,分离血清,测其效价,合格即大量采血。

(3)心脏采血

(4)分离免疫血清。

   

四、作业与思考

1.在动物体内制备免疫血清为何要多次注射?

2.制备大肠杆菌抗原时,使用石炭酸生理盐水和加热60℃1h的目的是什么? 

                   

实验3

环状沉淀反应

可溶性抗原与相应抗体反应,在有电解质的情况下,会产生细微的沉淀,称为沉淀反应。环状沉淀反应是使抗原抗体在沉淀管内形成交界面,然后在此交界面处出现—环状乳白色沉淀物,出现此环状反应的抗原最高峰,稀释度为沉淀素效价。

一、目的与内容

(一)目的

通过沉淀素的效价测定,学习环状沉淀反应的操作方法及结果观察。

(二)内容

鸡血清与免抗鸡免疫血清发生沉淀反应。

二、材料与用品

(一)材料

鸡血清、兔血清、免抗鸡免疫血清  

(二)用品

小试管、1ml吸管量筒、生理盐水

三、操作与观察

1.将鸡血清以1:25稀释,去该液1ml,用倍比稀释法稀释为各种浓度(1#1*、2# 2*……)分别表示自第1管、第2管中吸取1ml以此类推。)

2.将9个干洁小试管插在试管架上,使直立。

3.用吸管吸取1:2的免抗鸡免疫血清,加入小试管底部,每管约两滴。

4.用另一吸管吸取上面稀释的鸡血清(抗原),按下表加入各管。

从最高峰稀释度加起,加入时沿壁徐徐加入,使与下层免抗鸡免疫血清之间形成界面,切勿摇动。

5.室温静置15—30分钟,观察试管中的两液面交界处,有无白色沉淀出现。

6.结果记录:由白色沉淀“+”,无沉淀“—”,出现沉淀最大稀释度的试管其稀释度倒数为沉淀素效价。

四、作业与思考

     1.结果:

  

该沉淀素效价为

     2.试验时为何稀释抗原,而不稀释抗体?

实验4

玻片凝集反应

细菌细胞成红细胞颗粒抗原与特异性抗体结合后,在有电解质的情况下,会出现肉眼可以看见的凝集块,称为凝集反应。玻片凝集法主要利用抗血清来鉴定未知菌,也可用来显示免疫血清的存在,这是一种定性方法。

一、目的与内容

(一)目的

1.了解血清学反应的基本原则。

2.学习玻片凝集现象。

3.观察凝集现象。

(二)内容

    兔抗血清与与大肠杆菌发生凝集反应。

二、材料与用品

(一)材料

大肠杆菌、注射大肠杆菌抗原后的家兔

(二)用品

琼脂斜面、培养物、生理盐水、玻片、接种环、血清

三、操作与观察

    1.采集家兔血液10ml,离心,制备抗血清。

    2.以1:10用生理盐水稀释抗血清。

    3.在玻片一端用小滴管加1 滴1:10抗血清,另一端加1滴生理盐水。

    4.挑取少许细菌混入生理盐水中,再搅匀,挑取少许细菌混入血清,搅匀。

    5.将玻片略微摆动后,静置室温中,1—3 分钟后观察一端是否有凝集反应出现,另一端为生理盐水对照,仍未均匀混合。

四、作业与思考

     1.结果

2. 是否出现凝集反应,如没有分析原因?

3.为何采用生理盐水稀释血清,而不用蒸馏水?

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