小鼠巨噬细胞吞噬现象的观察

一、 实验目的

1.通过观察小鼠巨噬细胞吞噬红细胞的试验，了解巨噬细胞对异物吞噬的原理和功能。

2.了解巨噬细胞在机体非特异免疫中的重要作用。

二、实验原理

高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞，具有吞噬作用的功能。它们广泛分布在组织和血液中，在机体的非特异免疫功能中起着重要作用。

当病原微生物或其他异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又有趋化性，它通过产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行聚集，首先把异物吸附在细胞表面，随之，吸附区域的细胞膜向内凹陷，伸出伪足包围异物，并吞入胞质，形成吞噬泡，继而在细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡融合，形成吞噬溶酶体，把病原体杀死，异物消化分解。 巨噬细胞吞噬异物的能力在一定程度上反映了机体免疫水平的高低。

三、实验仪器、材料和试剂

1. 仪器、用具：显微镜、高压灭菌锅、解剖盘、解

剖剪、1ml注射器、吸管、载玻片、盖玻片。

2. 材料：小鼠（体重20g左右），鸡血。

入6.0克可溶性淀粉，促使溶解，再煮沸灭菌，置40C冰箱保存，用时水浴熔化，加入适量4%台盼蓝染液混匀，使呈蓝色。

四、方法与步骤

2.实验前，再向腹腔注射1ml 1%鸡红细胞悬液，并轻揉腹部，使鸡红细胞悬液分散。

3. 20-30min后，用脊椎脱臼法处死小鼠（右手抓住鼠尾，用力向后拉，左手拇指与食指同时按著鼠头后的颈部，使脊椎与脑髓间断开致死）。

4. 迅速剖开腹腔，用未装针头的注射器或吸管吸取 腹腔液。

5. 取一张干净载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片，放置2分钟~3 分钟后在显微镜下镜检。

观察时，将视野光线调暗。在高倍镜下，先分辨清鸡红细胞和巨噬细胞。鸡红细胞为淡黄色、椭圆形、有核的细胞。而数量较多、体积较大圆形或不规则的细胞，其表面有许多似毛刺装的小突起（伪足），胞质中有数量不等的蓝色颗粒（为吞入的含台盼蓝淀粉肉汤形成的吞噬泡）即为巨噬细胞。变换视野仔细观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程。可见有的鸡红细胞（一至多个）紧贴附于巨噬细胞的表面；有的巨噬细胞已将1至数个红细胞部分吞入；有的巨噬细胞已吞入一个或几个红细胞在胞质中刚刚形成椭圆形的吞噬泡；有的巨噬细胞内的吞噬泡体积缩小，并呈现圆形，这是与初级溶酶体发生融合，泡内物正在被消化分解。

六．注意事项

1、给小白鼠腹腔注射6%淀粉肉汤时要注意

进针适度，注射量要合适。

2、给小白鼠腹腔注射时，抓小鼠不要太

紧，以免小鼠死亡。

3、使用的载玻片要很干净。

 

第二篇：小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养20xx

细胞工程综合实验报告

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养

班    级         xxxx              

姓    名          xxxx             

学    号        xxxxxxxxxx        

指导教师        xxxx                 

实验时间        xxxx             

成    绩                         

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养

                      姓名        学号        班级

一、实验目的

   1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。

   2.初步掌握培养过程中的无菌技术。

   3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。

二、实验原理

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。

巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。
    培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。

    肾脏细胞:所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰酶消化能出去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。

三、主要试剂

小鼠1只、PRMI1640培养基、胰蛋白酶和EDTA 、PBS缓冲液 、青霉素 、链霉素、75% 酒精、蒸馏水

四、仪器设备

    解剖盘、镊子、剪子、手术刀、盖玻片、吸管、显微镜 、无菌操作台、5ml注射器 、注射针、试管、培养瓶等。二氧化碳培养箱 、生物显微镜、 高速冷冻离心机
 、 低温冰箱
五、实验步骤

5.1溶液的配置

5.2小鼠腹腔巨噬细胞原代培养
1、以颈椎脱臼法处死小鼠。
2、手提鼠尾将其全浸入75%乙醇中10s，倒立小鼠并向腹腔内注射预冷至培养液5ml（注意针尖勿伤及内脏），仰卧平放并轻揉小鼠腹部2～3min，静置5～7min。
3、置小鼠于解剖台，用针头固定四肢，在腹股沟区作一横切口，撕裂皮肤以完全暴露出腹膜壁， 但勿伤及腹膜壁。

4、用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动，并促使巨噬细胞从腹腔的浆膜表面释放，形成细胞悬液。
5、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。
6、小心拔出针头，把腹腔液注入离心管中。
7、将细胞悬液于4℃、1000r/min离心5min,弃上清,取3ml的加双抗的培养基进行吹打，放入培养瓶中，再在培养瓶中加入2ml的培养基。

8、将拧紧口的细胞培养瓶放进CO₂ 培养箱中，然后，将瓶口松1.5圈（保证细胞呼吸），平放着混匀细胞，过夜培养。

9、第二天进行细胞换液；第三天观察细胞生长情况并拍照。
5.3 肾脏细胞的原代培养

1、用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

2、点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等

3、取材

    取新生乳鼠一只，采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠入盛有75%酒精的烧杯中10秒，随即携入超净工作台内。

    在超净工作台内取出小鼠，置于消毒培养皿中打开消毒器械包用镊子掀起乳鼠腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，充分暴露腹腔，用另一镊子轻轻夹起肠管，翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中（去除肾盂、肾门和肾外表皮）用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污再将肾组织用解剖剪剪成几块再用PBS漂洗，去净血液为止。

4、消化

    将洗净的组织块移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至1mm³大小的组织块加入5-8倍量（体积）的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37?C细胞培养箱中消化30分钟，注意应每隔10分钟振摇一次。当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台内静置后用吸管吸去上清，加入一定量的培养液终止消化，反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态，让未消化完的组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入消毒离心管中离心。

5、离心

 离心管平衡后，以1000转/分离心10分钟，超净工作台内开盖，吸取上清液加入5ml培养液，盖盖，注意应有空隙，标明细胞名称，代数，日期，将培养瓶置于37?C细胞培养箱中过夜培养。

6、第二天进行细胞换液；第三天观察细胞生长情况并拍照。

六、实验结果

小鼠巨噬细胞 （六）                       小鼠肾脏细胞（六）

七、分析和讨论

    由以上实验结果可知，我组的实验很成功(基本上掌握了本次实验涉及的所有技术）。培养生长出来了较多较大的巨噬细胞，可以清晰地看到一粒粒的梭形巨噬细胞呈现在眼前，非常的清楚明了，甚至可以作为标本。说明此次巨噬细胞的培养特别成功。当然也得到了一定量的肾脏细胞，只是相对来说比较明显的肾脏细胞的量较少， 且只看到了一个。

分析原因：液体培养基在分装过夜处理时可能是染菌了， 不能用来进行小鼠细胞的培养， 只能借助于其他组的，其次在操作过程中也损失了部分肾脏细胞。

八、心得体会

1、细胞实验操作的实验要求要无菌操作尽量避免感染杂菌。       

2、本次实验的过程设计由我们各组自己查阅文献制定具体方案，所以，我们在操作过程中更能知道实验中每一个步骤的原理和目的，收获更大。

3、为了防止器皿表面的杂菌污染里面的细胞或培养液，在开盖前，先用75%的酒精擦拭瓶盖周围，再在酒精灯的外焰快速过火后开启瓶盖。千万不要在瓶口还较热的时候就从瓶子里到处细胞或培养液，这样会灼伤细胞，还可能破坏培养基的某些成分。

4、实验过程中做好实验记录，撑握好每一步的操作要求。

5、在给小鼠进行解剖及一系列操作时， 应尽量要把小鼠的肾脏细胞剪碎， 方便重于后面的处理。