实验二 琼脂糖凝胶电泳实验

一、实验目的

学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；
（2） 掌握使用水平式电泳仪的方法；
（3） 学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。

三、试剂与器材

（一）材料
电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等
（二）试剂
1、 50×TAE(1000mL)：242g Tris,57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。
2、 EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。
3、 DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。
①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。
②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。
③使样品呈色，使加样操作更方便。

四、操作方法

（一）常规的水平式琼脂糖电泳
制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：
琼脂糖的含量（%） 分离线状DNA分子的有效范围（Kb）
0.3 60-5
0.6 20-1
0.7 10-0.8
0.9 7-0.5
1.2 6-0.4
1.5 4-0.2
2.0 3-0.1

1．凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃ 时，加入 EB 至终浓度 0.5µg/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。
   注：胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；

2.加样 取10µl DNA样液与 2µl 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。
   注：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。
    3．电泳：电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。

注：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
   4．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。

注：EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。
（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、思考题

1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）

M   1    2   3    4

：

2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？

    

 

第二篇：实验七 DNA的琼脂糖凝胶电泳

实验七 DNA的琼脂糖凝胶电泳（4学时）

实验目的

琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

实验原理

琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA

核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。

影响核酸分子泳动率的因素主要是：

1、样品的物理性状

即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。

2、支持物介质

核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。

琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段

（5bp-500bp）的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的DNA分子。

3、电场强度

电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过4V/cm。而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

4、缓冲液离子强度

核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。

在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。 缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。

核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA损伤不是很大，所以也比较适用。

使用溴化乙锭对DNA样品进行染色，可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB。EB掺入DNA分子中，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，但是如果要测定核酸分子大小时，不宜使用以上方法，而是应该在电泳结束后，把凝胶浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10～30min进行染色。BE见光分解，应在避光条件下4℃保存。

材料、试剂及器具

1、材料

1kbMarker（分子量标准）；DNA样品

2、试剂

加样缓冲液（6x）：0.25%溴酚兰，40%蔗糖；琼脂糖；溴化乙锭（EB）；酶液（10mg/ml）。

3、器具

（1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。

（2）紫外透射仪。

操作步骤

1、按所分离的DNA分子的大小范围，称取适量的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。

2、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。

3、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。

4、.待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

5、在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面

6、把待检测的样品，按以下量在洁净载玻片上小心混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。

1μl加样缓冲液（6×）+5μl待测DNA样品

〔+0.5μlEB液（10mg/ml）（注：若胶内未加EB，可选用此法）。〕

7、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

8、观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。

9、染色：把胶槽取出，小心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上，放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约30min。

10、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm或254nm），通过观察孔进行观察。

注意事项

1、电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。

2、预先加入EB时可能使DNA的泳动速度下降15%左右，而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB，染色步骤可省略；若凝胶放置一段时间后才观察，即使原来胶内或样品已加EB，也建议增加此步。

3、加样进胶时不要形成气泡，需在凝胶液未凝固之前及时清除，否则，需重新制胶。

4、以0.5×TBE作为电泳缓冲液时，溴酚兰在0.5%～1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于300bp的线性DNA的泳动速度，而二甲苯青FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度。

实验报告

1、记录所观察的电泳图谱，注意每条带的相对位置及浓淡等。

2、判断实验37提取的质粒的相对分子量的大约数值，分析解释实验结果。

思考题

如何通过分析电泳图谱评判基因组DNA、质粒DNA等提取物的质量？