自己根据实验总结的Western blot

Western blot

一、试剂配制

1）细胞裂解液：

组分：Tirs-base（50mM），EDTA（10mM），Nacl（100mM），Triton-100（1%）

用双蒸水定容至50ml，于4℃保存。

2）PMSF：PMSF 0.0174g溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。注：PMSF工作浓度为0.1-1mM，此液为100mM母液，使用前加入细胞裂解液中，终浓度为1mM。PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣服应予丢弃。PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率高于4℃。pH值为8.0时，20umol/L的PMSF溶液的半寿期大约为35分钟（James，1978），这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

3）1.5M Tris-base PH8.8：Tris-base 18.17g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至96ml，调PH时约需4ml浓HCL。

4）0.5M Tris-base PH6.8：Tris-base 6.05g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至97ml，调PH时约需3ml浓HCL。

5）10%SDS：SDS 10g溶于60ml双蒸水中，68℃助溶，定容至100ml，注：由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95ml，等泡沫散去。

6）30%Acry/bis：丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，双蒸水定容至100ml，37℃助溶，-4℃保存。注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。

7）考马斯亮蓝G250工作液：

用双蒸水定容至100ml，过滤4℃保存。

8）10mg/ml牛血清白蛋白（BSA）母液：BSA 0.01g，生理盐水1ml，-20℃保存，使用时稀释为1mg/ml工作液。

9）5×SDS凝胶上样缓冲液（Loading Buffer）：

组分：1MTris-base PH6.8（250mM），SDS（10%），溴酚蓝（0.5%），甘油（50%），β-巯基乙醇（5%）

用双蒸水定容至5ml，小分（1ml）分装后，于室温保存，使用前将50ulβ-巯基乙醇加入每小份中，加入β-巯基乙醇Buffer可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。

10）TBST缓冲液：

用双蒸水定容至1000ml，调PH为7.4,4℃保存。

11)10%过硫酸铵（APS）：APS0.1g溶于1ml双蒸水中，4℃保存一星期有效，最好现配现用。

12)10%浓缩胶（7.5ml/两块胶）：

依次加入上述试剂后充分混匀，现配现用，为有毒试剂注意防护。

13）5%浓缩胶（5ml/两块胶）：

依次加入上述试剂后充分混匀，现配现用，为有毒试剂注意防护。

14)电泳缓冲液：

用双蒸水定容至500ml，由于SDS溶解过程中会产生泡沫，因此定容之后再加，现配现用。

15）转移缓冲液：

制胶完成后配制，用双蒸水定容至800ml，然后放入4℃冰箱预冷，使用时再加入200ml甲醇。

16）5%牛奶封闭液：伊利脱脂奶粉0.5g，TBST10ml，4℃保存，最好现配现用。

二、组织蛋白提取

1）吸取792ul细胞裂解液与8ulPMSF，充分混匀置于匀浆器里放在冰上备用。

2）打开4℃低温高速离心机，预冷。

3）称取0.05g组织样品于匀浆器中，然后加入匀浆器中研磨。

4）将匀浆液移入2mlEP管中，冰上裂解30min。

5）1,2000r/min，4℃离心15min，取上清即为蛋白，放入-80℃保存。

三、蛋白浓度测定

蛋白样品浓度=10×蛋白样品OD值/标准蛋白OD值，单位为ug/ul。

四、蛋白灭活

根据浓度计算出上样50ug蛋白所需体积分装于0.5mlEP管中，然后加入1/4体积的5×SDS凝胶上样缓冲液，95℃高温煮沸5min，-80℃保存，最好现配现用，可临时于-20℃保存。

五、Western blot操作过程

1）制胶：将制胶板固定好，按上述方法配好分离胶，充分混匀后倒入制胶板中，确保胶不漏，然后用双蒸水封闭，室温静置30min（配制电泳缓冲液及转移缓冲液），凝固后倒出双蒸水，用滤纸吸干，配置好浓缩胶，倒入制胶板中，然后插入梳子，室温静置30min（灭活蛋白）备用。

2）电泳：组装好电泳仪，红对红黑对黑，从密封的中间区域倒入电泳缓冲液，至漫过周边下方的金属丝，然后拔出梳子，加入蛋白样品及蛋白Maker。插上电源，浓缩胶区域电压设为60V（约30min），分离胶区域电压设为100V(约1h)，具体时间根据Loading Buffer把握。

3）转膜：将预冷后的转膜缓冲液中加入200ml甲醇混匀后倒置在托盘中，裁剪4张稍微小于转膜海绵的滤纸，于转膜液中浸泡15min，同时取出胶，切割目的胶片段，置于转膜液中，裁剪与之大小相同的NC膜于转膜液中浸泡15min。将转膜夹板置于托盘中，白色板在下，依次放置：白色夹板—海绵—2层滤纸—NC膜—胶—2层滤纸—海绵—黑色夹板。将夹板固定好后放入转膜槽中黑对黑白对红，接通电源，电压为100V，电流为250mA，时间为2h。注：转膜过程在冰里操作。

4）封闭：将NC膜取出，在Maker端剪个小角，与胶接触面标记为上，然后置于10ml 5%牛奶封闭液中，室温振荡摇匀1h。

5）洗膜：TBST洗膜三遍，每遍10min。

6）一抗孵育：按1:1000比例用5%牛奶封闭液配制一抗GAPDH10ml，4℃振荡摇匀过夜。或室温振荡2h，4℃过夜，一抗可回收重复利用。

7）洗膜：TBST洗膜三遍，每遍10min。

8）二抗孵育：按1:5000比例用牛奶封闭液配制二抗10ml，室温振荡摇匀1h。

9）洗膜：TBST洗膜三遍，每遍10min。

10）ECL显色：取A液与B液各500ul即为ECL显色液（1ml），混匀备用。暗室操作，所需准备的物品包括：200ul枪及枪头、暗盒、X胶片、剪刀、镊子、卫生纸、小平皿。将NC膜置于小平皿中，加入ECL显色液，关灯待观察有条带荧光后，取出置于暗盒中（避免气泡），用剪刀裁剪X胶片压在NC膜上，关闭暗盒，压片10s（压片时间根据荧光亮度决定），打开暗盒，取出X胶片放入显影液中2min，然后在水中清洗几遍，在放入定影液中2min。

第二篇：Western Blot 实验计划完整版

Western Blot 实验计划完整版

一、SDS-PAGE

1、分离胶的配制

10% 10%

30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 2.67 mL 4.005mL

去离子水 3.33 mL 4.995mL

分离胶缓冲液(4X) 2.00 mL 3.00mL

8.00 mL 12.00mL

10%(w/v)APS(现用现配) 45μL 67.5μL

TEMED 12μL 18μL

2、压缩胶的配制

30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 0.75 mL

去离子水 3.00 mL

压缩胶缓冲液(4X) 1.25 mL

5.00 mL

10%(w/v)APS(现用现配) 30μL

TEMED 8μL

先制备蛋白样品，后灌注压缩胶，压缩胶灌注后应在20~40min内使用。

3、蛋白样品的制备

蛋白样品 8μL

上样缓冲液(loading buffer/laemmili buffer) 12μL

煮沸5min

冷却至室温

短暂离心

之后可加样，加样孔的深度至少为5~8mm。

拔出梳子后，如加样孔有气泡，可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除从烧水开始，蛋白样品的制备大约需要35min

4、电泳

压缩胶电压：80V（10mA）

分离胶电压：120V（20mA）

当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时，即停止电泳。

5、染色

考马斯亮蓝染色液35min，摇床摇动（为获得最大分辨率，5%凝胶染色2小时，10%凝胶染色4小时）

用清水反复漂洗几次

高甲醇脱色液25min，摇床摇动（也可用7%（v/v）冰乙酸）

低甲醇脱色液，摇床摇动

二、Western blot

1、润湿

准备6张Whatman 3#滤纸、一张硝酸纤维素膜，尺寸与凝胶大小相仿，先放入水中3分钟，

放入转膜缓冲液中5分钟。

2、起胶

将凝胶从电泳槽中取出，放入转膜缓冲液中10分钟

3、三明治的制作

按以下顺序放置：3层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层Whatman 3#滤纸切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。

4、海绵的润湿

用转膜缓冲液将海绵润湿

5、转膜

将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。

1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to

PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).

2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to

PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent

(250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).

3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp

constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or

500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).

4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp

constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).

Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s

directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4. Please follow the manufacturer1s recommendations

6、清洗

将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！）

7、封闭

1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately

place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).

2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight

at 4℃.

8、一抗孵育

一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。

Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature.

Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.

9、清洗

将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。

10、二抗孵育

二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。

11、清洗

同13，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。

12、显色

按如下配方配制显色液：

1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C

将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。

? Perhaps the most common problem in western blotting is the occurrence of background staining. The best remedy for high background (in many cases) is simply to dilute the primary antibody further. Other solutions include ensuring that detergent is used in the blocking reagent, using an alternate blocking reagent (casamino acids, BSA, serum), and decreasing the amount of protein applied to the electrophoresis gel.

Occurrences of extra bands in the blot can be resolved by several strategies. Run a control blot omitting the primary antibody to determine if the secondary antibody is the source of the problem. Replacing the secondary antibody with a different lot or a similar reagent from a different source can provide resolution. Spurious bands below the targeted molecular weight suggest that the protein is being degraded in the experiment; inclusion of protease inhibitors can help.

No or low signal can be remedied by loading more protein in the gel or increasing the amount of primary and/or secondary antibody applied to the blot.

Some antibodies will not bind in the presence of detergent; consult the datasheet for each antibody prior to performing any procedure. ? ? ?

本实验所需全部试剂的配方：

SDS-PAGE

一、丙烯酰胺/双丙烯酰胺储液（30:0.8）1000mL

30%(w/v) 丙烯酰胺 300g

0.8%(w/v) 双丙烯酰胺 8g

加去离子水，至终体积1000mL。经0.22μm膜过滤。存于4℃暗处。

二、分离胶缓冲液（4X）

1.5mol/L Tris-HCL(pH8.0)

0.4%(w/v)SDS

500mL 1000mL

10%(w/v) SDS 20mL 40mL

加去离子水，至所需终体积。室温下用HCL调pH至8.0。经0.22μm过滤。存于4℃。

三、压缩胶缓冲液（4X）

0.5mol/L Tris-HCL(pH6.8)

0.4%(w/v)SDS

500mL 1000mL

10%(w/v) SDS 20mL 40mL

加去离子水，至所需终体积。室温下用HCL调pH至6.8。经0.22μm过滤。存于4℃。

四、电机缓冲液（4X）

0.1mol/L Tris

0.768mol/L 甘氨酸

4000mL 8000mL

甘氨酸 230.6g 461.2g

加去离子水，至所需终体积。不必调pH。此比例时Tris碱-甘氨酸的pH应为8.3。室温下存于大容器中。

五、SDS(10%;w/v)100mL

取10gSDS溶于去离子水中，至终体积100mL。室温下存于洁净瓶中。

六、电泳缓冲液（1X）

1/4体积的4X电泳缓冲液与3/4体积的去离子水混合。然后加1/100体积的10%SDS至终浓度0.1%(w/v)SDS。实例如下：

800mL

电极缓冲液 200mL

去离子水 592mL

10%(w/v)SDS 8mL

800mL

七、样品缓冲液(2X)储液 0.25mol/LTris-HCL(pH6.8)

4%(w/v)SDS

20%(w/v)甘油

痕量溴酚兰

配制此溶液时，应极小心，戴手套，并避免角蛋白（皮肤上即存在此蛋白）对缓冲液的污染。

100mL

压缩胶缓冲液（4X） 50mL

SDS(固体干粉) 4g

甘油 20mL

溴酚兰（溶液呈深蓝色） 2mg

加去离子水至100mL终体积。此缓冲液可室温下保存或等分冻干保存，但用前必须温热以确保SDS于溶液中。应保证反复使用此溶液的同一储液而不被污染。等分保存将有助于避免这个问题。

八、含2-巯基乙醇的样品缓冲液（1X）

用前配制样品缓冲液的工作液，稀释2X样品缓冲液，加入2-巯基乙醇至终浓度为5%（v/v）。例如：

2X样品缓冲液 100μL

去离子水 90μL

2-巯基乙醇 10μL

200μL

九、过硫酸铵（APS）(10%;w/v)

取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制。

十、考马斯亮蓝染色液（1000mL）

考马斯亮蓝R250 2.5g

甲醇 454mL

冰醋酸 92mL

去离子水 454mL

经Whatman #1滤纸过滤。

十一、高甲醇脱色液

1000mL 2000mL

甲醇 454mL 908mL

冰醋酸 75mL 150mL

去离子水 471mL 942mL

十二、标准（低甲醇）脱色液

1000mL 2000mL

甲醇 50mL 100mL

冰醋酸 75mL 150mL

去离子水 875mL 1750mL

Western Blot

一、膜转移缓冲液（Transfer buffer）

组分浓度：39mM Glycine, 48mM Tris, 0.037%(w/v)SDS, 20%(v/v)甲醇配制量：1L

配制方法：1、称量下列试剂，置于1L烧杯中。

Tris 5.8g

SDS 0.37g

2、向烧杯中加入约600mL的去离子水，充分搅拌溶解。

3、加去离子水将溶液定容至800mL后，加入200mL的甲醇。

4、室温保存。

二、TBS(5X)

组分浓度：100mM Tris-Base, 0.685M NaCl

配制量：500mL

配制方法：1、称量下列试剂，置于500mL烧杯中。

Tris-Base 0.6075g

NaCl 20.0157g

2、向烧杯中加入约400mL的去离子水，充分搅拌溶解。

3、调节pH至7.6

4、加去离子水将溶液定容至500mL后，4℃保存。

三、TBST(Washing buffer)

100mL 5X TBS

0.25mL Tween 20

Q.S.to 500mL

四、Blocking buffer(1%BSA in TBST)

20mL 5X TBS

1g BSA

Q.S.to 100mL

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