第三部分 实验部分
薄层层析采用 ,反应监测(TLC):较大量的反应用自制的薄层色谱板,小量的反应(50mg以内)使用高效薄层色谱板,采用5%的磷钼酸乙醇溶液显色。柱层析使用200-300目硅胶,产自 ,分离亚甲基醌类化合物时采用300-400目硅胶。洗脱剂为不同配比的石油醚和乙酸乙酯(经蒸馏提纯取低沸点部分,尽量减少长链烷烃的引入)。除特殊说明外,所用试剂均为分析纯。反应所需的溶剂,一般需经干燥,四氢呋喃(THF)、乙醚、二氯甲烷等用钠砂回流两小时及以上,丙酮经无水硫酸钙干燥,回流4小时。较敏感的反应在惰性气体Ar下进行。?H NMR 以300M型核磁共振仪及BrukerAM—400 型核磁共振仪测定,测样前可先将待测物用氯仿溶解并旋干反复三次,以减少乙酸乙酯、二氯甲烷、长链烷烃的残留,氘带氯仿作为测样溶剂,TMS 为内标,化学位移以ppm 计。
3.1 化合物8的制备
3.1.1.1化合物13的制备(Scheme 3-1)
室温下,将化合物12(1.000g, 4.85mmol)加入到25ml单口烧瓶中,再加入10ml乙腈,开启搅拌,使12溶解完全。加入1.05个当量的NBS(0.890g, 0.510mmol),于85℃下加热回流过夜,反应24小时以上,体系由无色变为深黄色。TLC监测时发现原料点和产物点的Rf
值相同,需尽量使原料反应完全,以免柱层析时难以分离。后处理:采用旋转蒸发仪旋干乙腈,加入乙酸乙酯和水萃取,无水硫酸钠干燥,干燥后过滤并收集粗产物旋干,旋干后干法上样,采用柱层析分离,用重蒸的石油醚淋洗,常压过柱。该反应产率大于90%,产物最开始为白色固体,但长期室温放置后,逐渐变黄。
氢谱?H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.374(s,18H), 5.156(s,1H),
7.253(s,2H)
3.1.1.2化合物14的制备(Scheme 3-2)
氩气保护,0℃下向氢化钠(1.49eq, 6.67mmol,177.8mg)的四氢呋喃(16ml)溶液中滴加化合物13(1eq, 4.48mmol, 1.27g)的四氢呋喃(4ml)溶液,加完后回复至室温搅拌1小时。0℃向其中0.47ml硫酸二甲酯(1.1eq),加完后控制加热回流,反应过程中不定期点板监测,回流一整天。后处理,冰浴下滴加水淬灭反应,然后旋干THF,加入乙酸乙酯和水萃取,无水硫酸钠干燥,过滤后旋干干法常压柱层析分离,石油醚淋洗。过程中有损失,产率未计。 氢谱(300MHz,CDCl3):δ1.473(s,18H), 3.728(s,3H), 7.407(s,2H)
3.1.1.3化合物15的制备(Scheme 3-3)
室温下将反应物14(1eq,1.25mmol, 0.6207g)溶于4ml四氢呋喃中,通入氩气排净体系中的空气,降温至-78℃,向其中滴加正丁基锂(规格为2.4M/正己烷),加入量为:1.1eq,0.60ml,加完后于-78℃下搅拌1小时。再加入一个当量的肉桂醛(0.15ml),搅拌反应两小时后,经TLC查看剩有少量原料,继续搅拌过夜至反应较为完全。后处理:滴加饱和氯化铵淬灭反应,旋干四氢呋喃,加入乙醚和水进行萃取,水相反萃三次,收集有机相并旋干上样进行柱层析分离,PE(石油醚):EA(乙酸乙酯)=15:1洗脱,收集单点的试管,浓缩后接通油泵(国产,极限压力为0.06Pa),减压下抽出有机溶剂,然后装样送去做核磁鉴定。
氢谱?H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.380(s,18H), 2.224(s,1H),
3.674(s,3H), 5.283-5.304(d,1H), 6.358-6.713(q,1H),
6.660-6.713(d,1H), 2.208-7.396(m,7H)
3.1.1.4 化合物15甲氧基的脱除
按照参考文献采用三溴化硼(2.4eq),0℃下二氯甲烷作溶剂,反应失败,体系变杂,没有主点。
又采用常用的乙硫醇钠(1.3eq,后来又补加)来脱除,DMF作为溶剂,80℃加热搅拌过夜,次日TLC点板监测结果为基本没有反应,遂
将温度升至120℃,反应了一天左右,原料依然没动,反应失败。 之后又将保护基换成了三甲基硅保护基,上保护这步产率很低,只有30%,加之平行的其他路线制得了化合物8,最终放弃了此条路线。
3.1.2 制备化合物8的方法尝试二
正丁基锂的量增至2.2个当量,操作同3.1.1.3,但不是没有反应就是发生了正丁基锂对羰基的加成。尝试过将温度升至-20℃,减少正丁基锂的加入量,体系颜色有很大的变化,由浅黄变深黄或墨绿,但都没有得到想要的产物。
3.1.3化合物8的制备
室温下将13溶于乙醚中,冷却至0℃,在氩气保护下滴入2eq的叔丁基锂(1.6M/正己烷),搅拌3h,加入1eq的肉桂醛,0℃下继续搅拌反应8h,点板后发现原料已反应完,滴加饱和氯化铵淬灭反应。后处理萃取干燥过滤完后,干法上样,进行柱层析分离,石油醚洗脱,即得目标化合物8。反应体系很杂,点板时有六七个点,过柱后将其他
两个主点送去做氢谱,但没有解出来具体结构。接下来,优化条件以提高产率,将叔丁基锂的量分别增至3eq、4eq,三个当量点板时有较明显的副反应,四个当量就只有一个主点,产率在40%以上(过柱过杂的部分没有计入)。之后,放大反应量时,过柱已经过不纯了,总是有杂质(有刺激性气味)同时出来,就改用丙酮重结晶,分离效果比较好。
氢谱?H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.322-1.370(d,18H), 6.844-6.884(d,0.91H), 6.940-6.965(t,1.3H), 7.015(s,0.5H),7.431-7.207(m,6.28H)
3.2 化合物9的制备
在两口瓶中将苯甲醛(1eq,4.84mmol,0.49ml)和2,6-二叔丁基苯酚(1eq,4.85mmol,1.000g)溶于16ml甲苯中,烧瓶一口用翻口塞封住,另一口接装有甲苯的分水器,分水器上方装有回流冷凝管,于140℃搅拌加热回流,于1h 内用微量注射器向其中滴加o.96ml的哌啶(3eq),加完后再补加0.1ml,加完后继续反应4h,将温度降至110℃,滴加入0.92ml乙酸酐(2eq)。反应5小时以上,还有部分原料剩余,一直未见原料减少就淬灭了。旋干甲苯后萃取,无水硫酸钠干燥,过滤后,过柱(干法上柱,石油醚洗脱)。产率大于25%(过程有意外损失)。
第二次重复此实验时,哌啶不加了0.3ml,产率有很大提高,提至50%左右。
氢谱?H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.583-1.618(18H,d), 7.300-7.308(1H,d),
7.477(1H,s), 7.543(1H,s), 7.675-7.751(5H,m), 7.805-7.813(1H,d)
3.3.1 化合物20的制备
将5ml化合物19和62.5mg硼氢化钠溶于18ml乙醇中,于50℃加热搅拌反应6h,滴加4mlHCl(3M),搅拌15min后,旋干乙醇,加入乙酸乙酯和水进行萃取,干燥并过滤浓缩后,进行柱层析分离,PE:EA=20:1淋洗,
得到产物并浓缩,油泵抽去残留溶剂,送去做核磁鉴定。
氢谱?H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.600(3H,d), 4.887-4.949(1H,m), 7.358-7.458(5H,m)
3.3.2 化合物21的制备
称取1.000g(1eq,0.85mmol)化合物12转移至25ml圆底烧瓶中,用针筒吸取1.5ml甲酸滴入装有化合物20(1.04eq,5.06mmol)的烧瓶中,用滴管润洗一下烧瓶侧壁后滴入25ml反应瓶中,再用针筒(1.00ml,一次性)吸取0.78ml乙酸滴入到装有化合物20烧瓶中,
洗一遍后滴入反应体系中 ,开启加热搅拌,加热温度为120℃。开始回流。反应6h,其间TLC监测原料还有部分剩余,但后期监测时发现原料浓度未变浅,就停止了反应。尽量旋干甲酸、乙酸,然后加入水和乙酸乙酯进行萃取,干燥过滤浓缩后,进行柱层析分离(PE:EA=100:1洗脱,烤板为蓝色,极性较大者为产物)。 产量为0.5839g,产率为0.39。
氢谱?H NMR(400MHz,CDCl3):δ 1.402(18H,s), 1.601-1.620(3H,s), 5.031(1H,s), 7.022(2H,s), 7.131-7.286(5H,m)、
3.3.3 化合物10的制备
室温氩气保护下,向装有59mg化合物21(1eq,0.19mmol)的10ml圆底烧瓶中加入5ml干燥的乙醚,再加入183mg氧化银(1.88eq,0.358mmol),开启搅拌。体系颜色变化依次为黄、蓝、绿、黄。一小时后,进行TLC点板监测,原料已经反应完全,停止搅拌,向体系中加入水和乙醚进行萃取。干燥过滤浓缩后,进行柱层析分离,湿法上样,石油醚淋洗。收集产物,送去做氢谱。
若将溶剂换为干燥的丙酮,体系变杂,点板时产物点浓度很淡,并且杂质点Rf值与产物点很接近。
氢谱?H NMR(400MHz,CDCl3):δ 1.171(9H,s), 1.364(9H,s), 2.522(3H,s),
4.194-4.139(1H,q), 7.010-7.017(1H,d), 7.258-7.288(2H,m), 7.372-7.421(3H,m),
7.500-7.509(1H,d)
3.4.1 化合物22的制备
0℃(冰浴)氩气保护的条件下,向装有0.75ml三氟乙酸酐(1.1eq,
5.34mmol)的烧瓶中加入0.5453g新戊酸(1.1eq,5.34mmol)和1g2,6-二叔丁基苯酚(1eq,4.85mmol),体系颜色由黄色变为紫色。反应时间为3.5h,原料略有剩余。滴加冰水,淬灭反应,加入乙酸乙酯进行萃取,无水硫酸钠干燥,过滤后旋干上样进行柱层析分离,淋洗液配比为 PE:EA=100:1,得到的产物为白色固体,送去做氢谱。
氢谱?H NMR(400MHz,CDCl3):δ 1.344(9H,s), 1.503(18H,s), 5.598(1H,s),
7.790(2H,s)
3.4.2 化合物23的制备
称取0.150g四氢铝锂(1.1eq,3.94mmol)加入到50ml烧瓶中,再加入15ml干燥的四氢呋喃,搅拌使之成为悬浊液,再将化合物22溶于5ml干燥的四氢呋喃中,0℃氩气保护下,将该溶液滴加到上述的悬浊液中,加毕撤去冰浴,室温下搅拌反应过夜。次日早点板原料已经反应完全,冰浴下滴加水淬灭反应。旋干四氢呋喃后,加入乙酸乙酯和水进行萃取,无水硫酸钠干燥并过滤浓缩后上柱,先用PE:EA=50:1的淋洗液将色素先分出,再加大极性为PE:EA=20:1,收集产物并浓缩后送去做氢谱。产物为白色颗粒状固体,产率为70%。
氢谱?H NMR(400MHz,CDCl3):δ 0.846-0.854(9H,d), 1.391(18H,s), 1.782(1H,s),
4.312(1H,s), 5.137(1H,s), 7.089(1H,s)
4.4.3 化合物24的制备
将化合物23(165.2mg,1eq,0.565mmol)转移至50ml烧瓶中,再
加入189.9mg二水合苯亚磺酸钠(1.6eq,0.904mmol),加入10ml乙酸、10ml水,搅拌溶解之,最后滴加几滴浓硫酸,于100℃加热搅拌反应。反应时间为8h。后处理:旋干乙酸,加入乙酸乙酯和水,进行萃取,无水硫酸钠干燥,过滤并浓缩后,进行柱层析分离,先用PE:EA=30:1的洗脱液分出杂质点后,加大极性为PE:EA=8:1进行洗脱,得到产物,送去做氢谱进行鉴定。产物为黄色粘稠状物质,产率为74%。
氢谱?H NMR(400MHz,CDCl3):δ 1.127(9H,s), 1.331(9H,s), 1.463(9H,s),
3.847(1H,s), 5.149(1H,s), 6.102-6.108(1H,d), 7.159-7.210(2H,t), 7.284-7.386(3H,m),
7.653-7.690(1H,d)
3.4.4 化合物11的制备
将化合物24(125.7mg。0.30mmol)转移至100ml圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷和20ml氢氧化钠溶液(1M),搅拌时转速应开大一些,反应6h,体系颜色变化为黄色加深。停止反应,加入乙酸乙酯和水,进行萃取,无水硫酸钠干燥,过滤并浓缩后,进行柱层析分离,湿法上样,石油醚淋洗。收集产物,得浅黄色晶体,产率为39%(过程中有意外损失,后重复操作时,产率可高达90%)。 氢谱?H NMR(400MHz,CDCl3):δ 1.284(9H,s), 1.331(9H,s), 1.335(9H,s),
6.430(1H,s), 6.759-6.766(1H,d), 7.569-7.577(1H,d)
在本文完成之际,首先要衷心地感谢我的导师樊春安教授。导师严谨求实的 治学态度、活跃的创新思维、敏锐的学术眼光必将使我受益终身。在此,谨对 导师给与我的不倦教诲和无微不至的关怀致以深深地感谢!
本论文也是在师兄陈鹏博士的精心指导下完成的。陈鹏师兄严于律己,思维 活跃,在我的学业即将步入新的阶段给与了我最直接、最无私的指导和传授。 在此向陈鹏师兄表示诚挚的谢意!
在论文的完成过程中,还得到了实验室师兄刘建东博士、张国彪硕士的无私 帮助和指导,在此表示最衷心的感谢。同时也向一直合作的丁明硕士表示感谢 最后,感谢我的父母和姐姐多年来对我的关心、理解和支持,谨以此文作为 对他们爱的回报。
2.1 药品及试剂
合欢花(干燥) 硝酸(分析纯)
双氧水(分析纯) 纯净水
各标准储备溶液的质量浓度0.1mg/ml,在使用时按需要再稀释。测定介质均为1%硝酸
2.2 实验仪器
2.3.1合欢花的消解
将药房买来的干燥合欢花剪碎,研磨,在电热恒温鼓风干燥箱中(105℃)干燥2h,精确称量重量,详情见表2.置于250ml锥形瓶中,加入HNO3-H2O2(4:1)混合液20ml。摇匀,常温下浸泡2天。然后,将其置于电炉上加热,保持微沸,加热过程中可不断加入纯净水,直至消解液呈淡黄色或无色透明,放冷,转入容量瓶,用1%的 HNO3溶液洗涤三角瓶,洗液合并于100ml量瓶中,作为K、Zn、Cu、Mg、Ca供试品溶液。同法制备相应测定元素的空白溶液。
表2 样品重量
2.3.2 仪器工作条件
考察5种待测元素的工作条件,查阅相关权威刊物,并分别对其进行优化选择,最佳工作条件见表3。
表3 FAAS工作条件
2.3.3 标准曲线的绘制及元素含量测定
在仪器允许的浓度范围内,制备含待测元素的对照品溶液5份,浓度依次递增,同时以相应试剂制备空白对照溶液。将仪器按规定启动后,依次测定空白对照溶液和各浓度对照品溶液的吸光度,并且记录读数。以每一浓度3次吸光度读数的平均值为纵坐标,对应其浓度为横坐标,绘制标准曲线。(用浓度为1%的HNO3 溶液进行定容至100ml,测定前原子吸收光谱仪开机预热40min以上)
用作图软件求出线性回归方程,相关系数r及曲线斜率S ,对空白溶液测定8次, 由空白溶液的吸光度值计算标准偏差σ,由3σ/S求出检出限。结果如下:
(一)K标准曲线及K元素含量的测定:
在K阴极灯波长为766.5nm ,标准溶液浓度分别为2.000ppm、4.000ppm、6.000ppm、8.000ppm、10.000ppm的条件下测得的K标准曲线,结果见表3。其线性回归方程为结果见表4。其线性回归方程为y=0.0826x-0.0527,相关系数R^2=0.9920,检出限LOD为0.009mg/L。可见仪器在工作范围内其线性关系良好。
表4 K标准曲线
(2)将处理好的待测样品稀释25倍用AAS进行测定K。 结果见表5
表5 合花花样品中元素初步测定结果 (μg.mL-1)
样品编号 K
1号 4.368
2号 4.384
3号 4.268
4号 4.102
5号 4.423
(二)Ca标准曲线及Ca元素含量的测定:
在Ca阴极灯波长为422.67nm ,标准溶液浓度分别为2.000ppm、4.000ppm、6.000ppm、8.000ppm、10.000ppm的条件下测得的Ca标准曲线,结果见表6。其线性回归方程为y=0.0145x+0.2852,相关系数为0.9987,检出限LOD为0.021mg/L。说明在工作范围内其线性关系良好。
表6 Ca标准曲线
(2)将处理好的待测样品稀释10倍用AAS进行测定Ca。结果见表7
表7 合花花样品中元素初步测定结果 (μg.mL-1)
样品编号 Ca
1号 3.669
2号 3.542
3号 3.769
4号 3.862
5号 3.663
(三)Mg标准曲线及Mg元素含量的测定:
在Mg阴极灯波长为285.21nm ,标准溶液浓度分别为0.500ppm、1.000ppm、2.000ppm、3.000ppm、4.000ppm的条件下测得的Mg标准曲线结果见表8。其线性回归方程为y=0.1126x+0.11069,相关系数为0.9887,检出限为0.003mg/L。说明在工作范围内其线性关系较好。
表8 Mg标准曲线
(2)将处理好的待测样品稀释10倍用AAS进行测定Mg。结果见表9
表9 合花花样品中元素初步测定结果 (μg.mL-1)
样品编号 Mg
1号 4.867
2号 4.929
3号 4.759
4号 4.722
5号 4.866
四) Cu标准曲线及Cu元素含量的测定:
在Cu阴极灯波长为324.8nm ,标准溶液浓度分别为0.200ppm、0.400ppm、0.600ppm、0.800ppm、1.000ppm的条件下测得的Cu标准曲线,结果见图10。其线性回归方程为y=0.0195x-0.0015,相关系数为0.9954,检出限LOD为0.027mg/L。说明在工作范围内其线性关系良好。
表10 Cu标准曲线
(1)将处理好的待测样品用AAS进行测定Cu。结果见表11
表11 合花花样品中元素初步测定结果 (μg.mL-1)
样品编号 Cu
1号 0.043
2号 0.042
3号 0.042
4号 0.050
5号 0.048
(五)Zn标准曲线及Zn元素含量的测定:
在Zn阴极灯波长为213.86nm ,标准溶液浓度分别为0.500ppm、1.000ppm、2.000ppm、3.000ppm、4.000ppm的条件下测得的Zn标准曲线,结果见表12。其线性回归方程为y=0.0093x-0.0022,相关系数为0.9283,检出限LOD为0.056mg/L.说明在工作范围内其线性关系较好。
表12 Zn标准曲线
(1)将处理好的待测样品用AAS进行测定Zn。结果见表13
表11 合花花样品中元素初步测定结果 (μg.mL-1)
样品编号 Zn
1号 2.145
2号 2.611
3号 2.335
4号 2.229
5号 2.342
即综上可总结:各元素浓度和吸光度均成良好的线性关系,相关系数在0.283--0.9987之间。而且,处理好的样品也大部分在线性范围内。
2.2.3对以上检测结果进行分析计算后,即得合欢花中各元素含量,见表14。
表11 合欢花中各元素含量测定结果 (n=5) (μg.g-1)
2.3.4加标回收实验
按照2.3.1中样品处理和测定方法, 采用标样加入法,取已知含量的合欢花样品5份,分别加入5 种元素的相应标准溶液。向其中加入各元素的标准溶液,按上述试验方法操作,重复3次,测定该方法的回收率,结果见表12。采用标样加入法测得加样回收率在95%~ 105%,结果说明该方法的准确度高。
表15 各元素回收率测定 (n=3) μg.g-1
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