考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量

摘要 

本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果表明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP)。

前言  

果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。以比活力(unit/mg protein)表示酶活力大小及酶制剂纯度时，可溶性蛋白的测定也是必不可少的。

1实验部分

1.1实验原理

比活力(unit/mg protein)表示酶活力大小及酶制剂纯度，同时采用考马斯亮蓝法测定蛋白质相结合，得到标准曲线。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。该方法标本用量少、灵敏度高、重复性好，是一种较为理想的方法^[7]。但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值、料液比和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。

1.2实验准备

1.2.1实验材料

新鲜苹果、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、85%磷酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、NaCl、MgCl₂ 、抗坏血酸、半胱氨酸、β-巯基乙醇。

1.2.2仪器与设备

容量瓶（25mL 10个、100mL 1个、500mL 1个、棕色瓶 1个、分析天平、胶头滴管、烧杯（50mL 2个）、移液管（20mL）、量筒（10mL 1个 、25mL 1个）、研钵；

UV-1800型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；旋涡混合器；PH计。

1.2.3试剂配制

1.2.3.1标准蛋白质溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)：称取牛血清蛋白 25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL；

1.2.3.2考马斯亮蓝试剂：称取50mg考马斯亮蓝G-250，溶于25mL 90%乙醇中，加入50mL 85g/100mL的磷酸，再用蒸馏水定容到500mL，摇匀，贮于棕色瓶中；

1.2.3.3提取液：pH 7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl缓冲液(100mmol/L)；

1.2.3.4梯度浓度Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)：10、30、50、80、100mmol/L；

1.2.3.5外源添加添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl₂(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、

半胱氨酸(2mmol/L)、β-巯基乙醇(2%，V/V)。

1.3实验步骤

1.3.1考马斯亮蓝G-250溶液及其蛋白反应液全波长扫描

取3mL配制好的考马斯亮蓝G-250溶液或其与蛋白反应液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度计在400～800nm范围内进行扫描，确定考马斯亮蓝G-250溶液和其蛋白反应液的最大吸收峰和空白吸收值。

1.3.2 标准曲线的绘制

取6支试管，按表1加入标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液。每加完一支试管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。混合后静置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm波长处测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得线性回归方程

表 1 绘制标准曲线的各试剂添加量

1.3.3 果蔬组织可溶性蛋白质的提取

1.3.3.1最佳缓冲溶液和pH值的确定

称取苹果果肉样品1g，加入5mL水或梯度pH值Tris-HCl缓冲液，冰浴上充分研磨匀浆，移入10mL离心管中，于4000rpm离心15min，收集上清液即为可溶性蛋白质提取液，低温保存备用^[8]。

1.3.3.2 最佳提取缓冲液浓度的确定

    以3.3.1 节确定的提取缓冲盐和pH值为基准，分别配制该pH值下浓度依次为0、10、30、50、80、100mmol/L的提取缓冲液^[9]。提取体系及方法同3.1节。

1.3.3.3 适宜外源添加物的确定

    以3.3.2节确定的最佳缓冲溶液为基准，分别添加以下浓度的添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl₂(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)和β-巯基乙醇(2%，V/V)。提取体系及方法同3.1节^[7-13]。（添加组合为：抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl₂、PVP＋β-巯基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巯基乙醇）

1.3.3.4苹果组织可溶性蛋白质含量的测定

    吸取1.0mL样品上清液，放入试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置5min后在波长595nm处比色，按照制作标准曲线同样的方法测定吸光度。重复3次。

1.3.3.5 数据处理

    Excel 统计分析所有数据，计算标准误差并制图。

4.实验基本路线

                   

1.4实验结果

2结果与讨论

致谢

参考文献

 

第二篇：考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量

考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量

原理：

考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000?g），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

材料、仪器设备及试剂

1、材料

小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料

2、仪器设备

分光光度计、研钵、烧杯、移液管

3、试剂

（1）标准蛋白质溶液：100?g·Ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。

（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。

方法：

1、标准曲线的绘制

取6支具塞试管，按表加入试剂。混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（?g） 0 20 40 60 80 100

2、样品测定

（1）样品提取：取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。

（2）吸取样品提取液0.1ml，放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。

（3）结果计算（单位mg/g）样品中蛋白质含量=（C·VT）/(1000 VS·WF) 式中：C—查的标准曲线值（?g）

VT—提取液总体积（ml）

WF——样品鲜重（g）VS—测定时加样量（ml）参考文献：郝建军，康宗利，于洋，

植物生理学实验技术，北京：化学工业出版社，2006.12，107-109