蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法

（实验报告）

实验日期：2015年4月28日   实验温度：室温

实验地点：生物化学与遗传学实验室   指导老师：***

班级：2013级生物技术1班   姓名：**   学号：********

I.实验目的

    1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；

    2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。

II.实验原理

    考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。

    考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。

    蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。

III.实验试剂与仪器

   1.实验试剂

    (1) 100μg/mL标准蛋白质溶液  5mg酪蛋白溶于50mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液      。

(2)考马斯亮蓝G-250试剂  50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。

(3)正常人血浆。

   2.实验器材

    可见分光光度计，100μL 微量移液器16支，5mL刻度吸管8支，中试管。

IV.实验操作步骤

    1.绘制标准曲线  取中试管8支，按下表加入各种试剂

    混匀，室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白，记录于下表，绘制标准曲线。

标准曲线绘制数据表

    2.样品测定  中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A₅₉₅于标准曲线查蛋白质含量。

V.实验结果分析

    结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；③人为操作不当，导致误差。

VI.注意事项

    1. 考马斯亮蓝试剂加入后室温放置5～20min内比色，布的超过1h；

2. 蛋白质-染料复合物少量附于比色杯，不影响测定，可用乙醇洗净。

 

第二篇：考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量

实验一考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量

【实验目的】

1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。

2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。

【实验原理】

1976年Bradford等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm变为595 nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 mg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

【仪器与试剂】

1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。

2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。

【实验步骤】

1．标准蛋白质溶液的配制

称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml的溶液。

2．蛋白试剂的配制

称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。

3．标准曲线的制作

取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 ml于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。

4．样品测定

取含10~100 mg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。根据吸光度值计算样品中蛋白质的含量。

【实验结果】

1．绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

2．计算蛋白质的含量。

【注意事项】

1．牛血清白蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度确定称取量，或根据牛血清白蛋白的紫外吸光系数为6.6来确定。

2．一些阳离子，如K⁺、Na⁺、Mg²⁺、(NH₄)₂SO₄和乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如Triton X-100和SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。

3．如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20分钟内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的；比色反应需在1小时内完成。

4．测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的；测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

实验二 3、5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量

【实验目的】

1．掌握3、5-二硝基水杨酸比色法测定糖含量的原理和过程。

2．了解糖含量测定的干扰因素。

【实验原理】

还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。 它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色物质颜色深浅程度与还原糖的含量成一定比例关系，在波长为520nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。

对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1 - 18/180 = 0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。

【仪器与试剂】

1．紫外-可见分光光度计，恒温水浴。

2．3、5-二硝基水杨酸试剂，6mol/L盐酸，10%氢氧化钠，酚酞指示剂，碘-碘化钾溶液。

3．无水葡萄糖（AR），山芋粉。

【实验步骤】

1．葡萄糖标准液的配制

精密称取预先在105°C干燥至恒重的无水葡萄糖100 mg，用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100 ml容量瓶中，再加水定容至刻度，摇匀，即得浓度为l.0 mg/ml的标准溶液。

2．总糖样品液的制备

精密称取1 g山芋粉，置锥形瓶中，加入6 mol/L盐酸液l0 ml和水15 ml，在沸水浴中加热0.5小时，取出1～2滴置于白瓷板上，加l滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈蓝色。冷却后加入l滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤，滤液加水定容至100 ml。再精确吸取上述溶液l0 ml于100ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用。

3．还原糖样品液的制备

精密称取2 g山芋粉，置100 ml烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50～60ml蒸馏水，于50°C恒温水浴中保温20分钟，过滤，将滤液收集在100 ml容量瓶中，加水定容至100 ml。

4．标准曲线的制作

取5支试管，分别加入0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 ml葡萄糖标准液，加水至2.0 ml后，再加入3、5-二硝基水杨酸试剂1.5 ml；混合均匀，在沸水浴中加热5分钟；取出后立即用冷水冷却至室温。再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀；用2.0 ml水作为空白，于520 nm波长处测吸光度（A）值。以葡萄糖质量（mg）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。

5．样品中总糖和还原糖的含量测定

分别取1.0 ml总糖样品液或还原糖样品液，加入蒸馏水1.0 ml和3、5-二硝基水杨酸试剂1.5 ml，其余操作均与标准曲线的制作相同。以2.0 ml蒸馏水作空白对照，平行测定3份样品液。测定后，根据样品的吸光度平均值在标准曲线上查出相应的糖量，用下式计算出山芋粉中还原糖与总糖的百分含量。

式中，C_X和C_X′分别为样品水解前和水解后的还原糖浓度，D为样品溶液的稀释体积，W_X为样品称取量。

【实验结果】

1．绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

2．计算还原糖和总糖的含量。