实验七紫外吸收法测蛋白质浓度
姓名:周超
同组者:刘炳煜
班级:11级生命基地
学号:201100140067
【实验目的】
1、了解紫外吸收法测蛋白质浓度的原理
2、熟悉紫外分光光度计的使用
【实验原理】
蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸,在紫外光280nm波长处有最大吸收峰,一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比,故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。
由于核酸在280nm波长处也有光吸收,对蛋白质的测定有一定的干扰作用,但核酸的最大吸收峰在260nm处。如同时测定260nm的光吸收,通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶液中存在核算时必须同时测定280nm及260nm的吸光值,方可通过计算测得溶液中的蛋白质弄浓度。
【实验材料】
一、器材
UV-9100型紫外分光光度计
试管7个
移液管
摇匀器
洗瓶
二、试剂
标准酪蛋白 1mg/ml
样品血清(稀释100倍)
蒸馏水
【实验步骤】
一、直接测定法
1、在紫外分光光度计上,将样品血清溶液小心盛于石英比色皿中,以水为对照,测得280nm和260nm两种波长的吸光度(A280nm及A260nm)
2、当A280nm/A260nm﹤1.5时,将280nm及260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度:
C=1.45A280nm-0.74A260nm
式中 C:蛋白质质量浓度(mg/ml)
3、当A280nm/A260nm﹥1.5时,将280nm及260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度:
血清蛋白质量浓度(mg/ml)=(A280nm/6.3)×10
二、标准曲线法
取7支试管,按下表加入试剂。
加毕,混匀,用紫外分光光度计测A280nm,以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,对1-7号作图,测样品管的A280nm,对照标准曲线求得蛋白质浓度。
【实验结果】
一、直接测定法
1、C=(1.45A280nm-0.74A260nm)*2*100=72.4mg/ml
2、C=[(A280nm/6.3)*10]*2*100=128.0 mg/ml
二、标准曲线法
C=0.403/0.8424*2*100=95.6mg/ml
【结果分析】
三种计算测定和计算方法得出三个数值:
使用公式C=(A280nm/6.3)*10计算得到的数值准确性最差,因为实验数据不满足该公式的使用条件A280nm/ A260nm〉1.5。
使用公式C=1.45A280nm-0.74A260nm计算得到的数值准确性最高,因为实验数据满足该公式的使用条件A280nm/ A260nm〈1.5,同时,还消除了核酸对实验数据的影响。
使用标准曲线法得到的数值较使用公式C=1.45A280nm-0.74A260nm计算得到的数值准确性稍差,标准曲线法仅使用了A280nm的数据,但因为核酸在280nm波长处也有光吸收,会对实验结果造成干扰,造成结果偏大。
【思考讨论】
1、紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法的优缺点:
优点:简单、灵敏、快速、高选择性。不消耗样品,测定后仍能回收使用;低浓度的盐和大多数缓冲液都不干扰测定,适合柱层析洗脱液的快速连续检测。
缺点:仪器昂贵,不同的蛋白质的紫外吸收是不相同的,测定结果存在着一定的误差。准确度较差,干扰物质多;在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪蛋白和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差;样品中若含有嘌呤、嘧啶及核算等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰;测定时受样品的PH影响较大。
2、直接测定法与标准曲线法比较
直接测定法:操作简单,快捷方便,不消耗样品,样品扔能回收利用;可以有效消除核酸的干扰,实验结果较准确,它还适用于硫酸铵或其他盐类物质混杂的情况。但是不同蛋白质及核酸的光吸收率不完全相同,还是会产生些许误差。
标准曲线法:简单常用,但是实验结果准确性较差,干扰因素多,比如酪蛋白和色氨酸含量的差异、嘌呤、嘧啶及核算等都会对实验结果造成干扰。
2、注意事项:
(1)制作标准曲线时,加样一定要准确。
(2)测量吸光度时,比色皿要保持洁净,切勿用手玷污其光面。
(3)注意直接测定法中公式的使用条件。
蛋白质浓度的测定
一.实验原理
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在465nm。当他与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感性。
在一定范围内,考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后,在595nm下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可用于蛋白质浓度的测定。
二.实验设备与试剂
设备:普通离心机,721型分光光度计
试剂:标准蛋白液(100ug/ml)
三.实验材料
新鲜绿豆芽
四.实验内容
1. 标准曲线的制备
取9支干净的试管,按表进行编号并加入试剂。
2. 样品蛋白的测定
(1) 样品蛋白液制备
准确称取2g新鲜绿豆芽胚轴的部分,研磨成匀浆,离心分离(4000r/min,10min)。取上清液用0.9%nacl定容到10ml。
(2) 含量测定
另取两只干净的试管,加入样品液0.1ml,0.9mlnacl和考马斯亮蓝染液4.0ml,混匀。室温静置3min,与波长595nm处比色,读取吸光度。
五.实验结果
1. 标准曲线
结果如表所示,并以吸光度为纵坐标,个标准液含量为横坐标做标准曲线。
2. 样品蛋白含量的测定
样品蛋白的比色结果如表,根据直线方程求出每支试管中蛋白质含量。
根据公式求出样品绿豆芽蛋白质含量
样品蛋白的体积
蛋白质含量(ug/g鲜重)= 测定时取样的体积
称取样品的重量
六.结果与讨论
结果: 绿豆芽蛋白质含量=1233.0ug/g
讨论:
1.试液为混合均与就取样
2.量取溶液时读数有误差
3.读取A值时有读数误差
4.比色杯中的误差
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