实验5   蛋白质含量测定（考马斯亮蓝法）

一、实验目的

蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法通过本实验学习考马斯亮蓝G-250测蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和比色法中的应用。

二、实验原理

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料，在游离状态下溶液呈棕红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色。蛋白质含量在0~1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法进行定量分析。

三、仪器设备

分析天平；具塞刻度试管 10ml×8；吸管 0.1ml×1, 1ml×2, 5ml×1；研钵；漏斗；离心管 10ml；容量瓶 10ml×1；离心机；721分光光度计

四、试剂

（1）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100ug/ml的原液。

（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取考100mg马斯亮蓝G―250溶于50ml90%乙醇中，加入85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水稀释至1000ml。

五、实验材料

绿豆牙

六、实验步骤

1．标准曲线制作

取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。

盖上盖子，摇匀。放置2min后在595nm波长下比色测定（比色应在1h内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

2.样品中蛋白质含量的测定

（1）准确称取200mg绿豆芽胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r/min,10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定容至刻度。

（2）另取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，再加入0.9ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝染液G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号管做空白参比，在595nm波长下比色，记录吸光度。

3.结果处理：

根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：

 

注意事项：

比色应在出现蓝色2min~1h内完成。

七、思考题

1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么，还有哪些蛋白质定量法？

2．如何正确使用分光光度计？

 

第二篇：实验二 蛋白质含量的测定

实验二 蛋白质含量的测定（Folin-酚法）

一、研究背景

  蛋白质是与生命、与各种形式的生命活动联系在一起的物质。可以说没有蛋白质就没有生命。它是机体的重要物质基础，机体的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质的结构千差万别，具有多种多样的生物学功能：例如酶的催化作用、激素的生理调节作用、血红蛋白的运载作用、肌纤维蛋白的收缩作用、机体的免疫作用和胶元蛋白的支架作用等。蛋白质不仅是构成各类细胞原生质的主要物质，而且核蛋白及其相应的核糖核酸还是遗传的主要物质基础。因此，建立正确的测定蛋白质含量的方法很重要。本实验所采用的Folin-酚法就是其中一种。

二、实验原理

Folin-酚法是一种根据蛋白质侧链基团中的特殊残基进行含量测定的简便而灵敏的方法。其理论基础是蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸的残基数与蛋白质成正比。

Folin-酚试剂由两部分组成：试剂甲相当于双缩脲试剂，在碱性条件下含一定量的二价铜离子，Cu ²⁺在OH^-条件下可与蛋白质中的肽键形成络合物。试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原，生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，在650nm下有光吸收。由于蛋白质中存在含有酚基的氨基酸，所以上述络合物可与试剂乙反应，而其反应颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，从而可以据此测定蛋白质的含量。

三、仪器与试剂

1、仪器

 （1）722型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司

 （2）架盘天平：北京天平物华医疗器械有限公司

2、试剂

 （1）试剂甲：相当于双缩脲试剂。

 （2）试剂乙：磷钨酸和磷钼酸混合液。

 （3）250微克/毫升的牛血清白蛋白标准原液

四、实验步骤

  1、配制系列牛血清蛋白溶液

取具塞试管6支，按表一加入牛血清白蛋白标准原液及蒸馏水。编号1~6备用。

  2、配制样品溶液

称取绿豆芽下胚轴1克于研钵中，适当滴加蒸馏水，匀浆。转入50毫升容量瓶中，定容。尔后过滤得到样品液。

取具塞试管两支，编号7,8。分别加入滤液1毫升。

  3、标准液及样液的测定

     同时在8支试管中加入试剂甲5毫升，混合后在室温下放置10分钟。后再同时加试剂乙0.5毫升，立即混合均匀。半小时后，以不含蛋白质的1号试管为对照，与其他7支试管内的溶液依次用分光光度计于650nm波长下比色。记录各试管内溶液的消光值。取样液的平均值进行计算。

  4、绘制标准曲线与计算

     以消光值为纵坐标，以牛血清白蛋白含量（微克/ml）为横坐标，绘制标准曲线。查出测定液中蛋白质的含量X（微克/ml），计算样品中的蛋白质的百分含量。

五、数据整理和计算

表一 标准溶液和样品的ＯＤ_６５０值

样品中蛋白质含量（%）=X(ug/ml)*样品总体积（ml）*100

                                 样品重（g）*10⁶

将数据X（ug/ml）=93 ug/ml代入公式

样品中蛋白质含量（%）=93*50*100/(1*10⁶)=0.465 %

六、结果分析

经过本实验的数据计算，得到绿豆芽中蛋白质含量为0.465%，与其他实验组的同学讨论得知，所测得的含量都与我组所测的数量级相同。分析可知，豆芽不同，生长所需要的条件和时间也不尽相同，所以数据会有一定偏差。此外，在用电脑作图时，添加趋势线的精确度不同，得到的样品的蛋白质含量也不同，也会造成轻微的影响。

七、思考题

1． 为什么要求加入试剂乙后立即混匀？否则将会如何影响测定结果？

已知试剂乙未磷钨酸和磷钼酸混合液，乙试剂在酸性条件下较稳定，在碱性条件下极不稳定。又知Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液，所以加入试剂乙后要立即混匀，以便在在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前，使还原反应发生。否则试剂乙含量减少，使得蛋白质与试剂甲作用后的溶液不能完全反应，以致所测蛋白质含量偏低。

2． 试分析本实验方法中的干扰因素。

本实验方法中从物质角度分析蛋白质中氨基酸的R基团中的酚类物质，豆芽中的柠檬酸、甘氨酸、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。从实验过程分析，反应的操作时间不易控制，如：加入试剂乙后迅速混匀等。

3． 为什么测定同一类甚至同一种物质的含量会有多种测定方法？

每一种测量方法都有各自的特点，即各有各的优缺点。我们在选择测量方法时，要考虑实验对测定所要求的灵敏度和精确度，存在的干扰因素，测定所要花费的时间等等方面。所以会有多种测定方法。

4.   蛋白质的测定方法有哪些？各有什么特点？

   凯氏定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford法）。

   （1） 凯氏定氮法：灵敏度低，误差为 ±2％， 费时。

   （2） 双缩脲法（Biuret法）： 灵敏度低，中速，用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似。

（3）紫外吸收法： 较为灵敏，快速 。利用蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收。

（4）Folin－酚试剂法（Lowry法）： 灵敏度高，慢速；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化。

（5）考马斯亮蓝法(Bradford法)： 灵敏度最高，快速。考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm。

八、参考文献

1.《蛋白质测定方法评价》：路苹，于同泉，王淑英，王建立，杨柳；《北京农学院学报》，第21卷，第2期，20##年4月

2. 《不同萌发期绿豆芽蛋白质含量的测定及营养价值分析》：李瑞国，朱秀敏，杨慧 ；《山东农业科学》，20##年01期

九、实验小结

在预习本实验时，我觉得应该能很快完成实验，但实际上我们成了最后一组。问题在于操作还不是很熟练，遇到突发情况反应太慢。在测消光值时还把比色杯磨砂面对准了透光孔，导致实验数据出现较大波动而重新测量。这些问题都不应该出现，在以后的实验中会尽量避免。此次的实验不仅仅在锻炼我的操作能力，也让我对蛋白质的测量方法有了深刻的了解，查阅了多种测量方法，加深了对蛋白质的学习。