琼脂扩散试验（以测定鸡法氏囊琼脂抗体试验为例）

1．制板

琼 脂   1g

蒸馏水  100m1     充分加热溶化，分装于培养皿中（不需无菌操作），厚度3-4mm。

氯化钠  8g

2．打孔  在制备好的琼脂板上用打孔器打梅花孔(中间1孔，周围6孔，如下图），将孔内琼脂用针头挑出（针头斜面向上）。

3．封底  用酒精灯轻烤打孔部位至底部琼脂板稍微溶化（手背感觉微烫手），封闭孔底，以防侧渗。

4．加样  原则：（1）已知的加在中间，未知的加在周围；（2）满而不溢。

用微量移液器吸取法氏囊抗原加入中间孔，卵黄抗体加入1-4孔，生理盐水加入5-6孔。

每种样品对应一个滴头。今天上午抗原和生理盐水用一个吸头，先吸生理盐水再吸抗原。

卵黄抗体用前要摇匀。

 5．反应（扩散）  加样完毕后，加盖。正放静置5～10min，然后将培养皿倒置于湿盒中，37℃温箱中作用，分别在24h、48h、72h观察并记录结果。

 

琼脂扩散打孔示意图

7孔加抗原，1-4孔加卵黄抗体，5-6孔加生理盐水。

6．结果判定

(1)判定方法  标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。

(2)判定标准  若被检血清孔与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原和标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性。

吻合为阳性。

被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，但标准阳性血清的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性(凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性)。 

内弯为阳性。

若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，且标准血清沉淀线直向被检血清孔或标准阳性血清的沉淀线一端向被检血清孔外侧弯曲，，则被检血清判为阴性。 

直向或外弯为阴性。

被检血清(如图中3号)孔与中心孔之间沉淀线粗而浑浊或标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸，被检血清孔为非特异反应，应重做，若仍出现非特异反应则判为阴性。 

交叉为非特异性，应重做。

 

第二篇：实验七、双向琼脂扩散试验

实验七、琼脂扩散试验

一、实验目的

掌握双向琼脂扩散试验的原理、操作方法及结果判定方法。

二、实验原理

可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。

三、材料与试剂

传染性法氏囊病毒标准抗原、传染性法氏囊病毒标准阳性抗体，待测鸡血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。

四、操作步骤

1、将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装入三角烧瓶，煮沸，然后用吸管吸取7ml加入平皿内（勿有气泡）使成约3mm厚的凝胶，待冷却凝固后按如下图方式打孔。（注意打孔完毕要封底）

2、加样。中间孔加标准抗原，外周孔加被检血清及阳性血清（如要测被检血清的效价，外周孔可倍比稀释后依次加入）。

3、将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

结果判断：阳性：标准对照孔之间有明显的沉淀线时，受检孔与中央孔之间形成沉淀线并与阳性对照沉淀线融合。阴性：受检孔与中央孔之间无沉淀线。

五、注意事项

1、每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加满，又必须不使样品溢出孔外。

2、打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。

六、实验报告

1、说明环状沉淀试验检测结果；

2、画出双向琼脂扩散试验中你所观察到的沉淀线，并对其进行简要说明。

3、思考题

（1）影响琼脂扩散试验结果的因素有哪些？

（2）若试验结果观察不到沉淀线，可能原因有哪些？